基于股骨組織形態(tài)學(xué)變化進行種屬鑒別

辛彩蕊，柏思，秦治家，高涇尚，林子清，程亦斌

（1.西藏警官高等?？茖W(xué)校，西藏拉薩 850000；2.北京盛唐司法鑒定所，北京 100039；3.中國刑事警察學(xué)院法醫(yī)系，遼寧沈陽 110854；4.西藏自治區(qū)公安廳物證鑒定中心，西藏拉薩 850000；5.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海 200063）

基于股骨組織形態(tài)學(xué)變化進行種屬鑒別

辛彩蕊1，柏思2，秦治家3，高涇尚4，林子清3，程亦斌5

（1.西藏警官高等專科學(xué)校，西藏拉薩 850000；2.北京盛唐司法鑒定所，北京 100039；3.中國刑事警察學(xué)院法醫(yī)系，遼寧沈陽 110854；4.西藏自治區(qū)公安廳物證鑒定中心，西藏拉薩 850000；5.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海 200063）

目的研究成年人，成年黃牛、馬、家豬、山羊、綿羊、狗、貓、長毛兔、鵝、鴨、雞共11種動物股骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，建立有效的種屬鑒別方法。方法取進行尸體檢驗的成人（20周歲以上）右股骨中段約4cm，同時取11種常見動物右腿股骨中段約4cm，脫鈣后制作成骨組織切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，選取25個指標(biāo)按人與哺乳動物、人與家禽、人與11種動物進行逐步判別分析。結(jié)果股骨中段骨密質(zhì)的組織學(xué)結(jié)構(gòu)具有明顯的種屬特征，且骨單位形態(tài)和數(shù)量呈現(xiàn)明顯的生物進化趨勢。選出11項指標(biāo)建立人與11種動物的種屬判別方程，人與哺乳動物的正確判別率可達96.3%，人與家禽的正確判別率可達100%，人與11種動物的正確判別率可達89.4%。結(jié)論本研究建立的人與其他種屬動物的判別方程具有較高的正確判別率，可以用于實際檢案中的種屬鑒別。

法醫(yī)人類學(xué)；股骨；人類；哺乳動物；家禽；種屬鑒別

常見動物與人類生活密切相關(guān)，尤其常見的哺乳動物，由于經(jīng)常涉及與刑事案件中的人體骨骼進行鑒別，所以很早就受到刑事專家們的重視[1-2]。近年來隨著動物保護意識的增強和相關(guān)法律的完備，動物間的種屬鑒別案件也越來越受到關(guān)注。目前報道[3]的骨骼種屬鑒別主要集中在長管狀骨的表面形態(tài)、骨單位、哈弗氏管和哈弗氏系統(tǒng)的形態(tài)和數(shù)量等方面，研究的動物種類較少，而且研究時使用的動物個體數(shù)量也很少，所以得出的結(jié)論有時相矛盾[1-2]。

本研究收集400例成人個體和11種常見動物

（每種50頭）的股骨標(biāo)本，利用光學(xué)顯微鏡及相關(guān)測量軟件，觀察和測量25項微細結(jié)構(gòu)，以確立具有明顯種屬差別的觀測指標(biāo)，建立利用骨組織學(xué)方法進行人與常見動物間的種屬鑒別方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象

從沈陽市公安局和中國刑事警察學(xué)院2013年1月至2014年12月尸體檢驗案例中隨機選取400例尸體，在征得死者家屬或相關(guān)人員同意后，取死者右腿股骨中段約4cm備檢。在遼寧省、吉林省和廣東省的各屠宰場收集成年黃牛、馬、家豬、山羊、綿羊、狗、貓、長毛兔、鵝、鴨、雞右腿股骨中段約4cm，每種動物采集50頭（只）備檢。收集的人及動物骨骼標(biāo)本要求沒有明顯畸形和肉眼可見的疾病。

1.2 處理方法

將上述檢材鋸成厚約0.5cm的薄片后，在10%甲醛溶液中固定3d，放入5%硝酸溶液中脫鈣3d（每天更換脫鈣液），水洗12h后用Cryotome FSE冰凍切片機（美國Thermo Fisher Scientific公司）切成厚約25μm的切片，經(jīng)硫堇/苦味酸染色后，分別在40、100、200、400倍CX31三目生物顯微鏡（日本OLYMPUS公司）下拍攝圖片，輸入計算機，并用數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)［麥克奧迪（廈門）醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司］觀察和測量選定的各項指標(biāo)。

1.3 觀察指標(biāo)

為了全面研究股骨密質(zhì)骨的組織學(xué)形態(tài)特征，從環(huán)層骨板、骨單位以及骨細胞等多個層次選定了以下25個指標(biāo)，包括哈弗氏系統(tǒng)數(shù)量（X1）、哈弗氏系統(tǒng)直徑（X2）、哈弗氏系統(tǒng)面積（X3）、環(huán)層骨板數(shù)量（X4）、哈弗氏管直徑（X5）、哈弗氏管面積（X6）、骨小梁寬度（X7）、骨小梁間距（X8）、骨小梁面積百分比（X9）、內(nèi)環(huán)骨板厚度（X10）、內(nèi)環(huán)骨板相對厚度（X11）、外環(huán)骨板厚度（X12）、外環(huán)骨板相對厚度（X13）、非哈弗氏管數(shù)量（X14）、骨陷窩數(shù)量（X15）、骨陷窩面積（X16）、哈弗氏系統(tǒng)形態(tài)（X17）、骨單位排列情況（X18）、舊骨單位的形態(tài)（X19）、舊骨單位的排列情況（X20）、舊骨單位環(huán)層骨板形態(tài)（X21）、骨小梁起始部骨單位情況（X22）、舊骨單位的環(huán)層骨板數(shù)量（X23）、骨陷窩的排列情況（X24）、舊骨單位數(shù)量（X25）。其中，哈弗氏系統(tǒng)形態(tài)（X17）、骨單位排列情況（X18）、舊骨單位的形態(tài)（X19）、舊骨單位的排列情況（X20）、舊骨單位環(huán)層骨板形態(tài)（X21）、骨小梁起始部骨單位情況（X22）、骨陷窩的排列情況（X24）為分類數(shù)據(jù)，未見到定義為0，可見且排列整齊定義為1，可見但排列不整齊定義為2。

首先在40倍、100倍鏡下初步觀察骨單位和舊骨單位的排列狀況，200倍鏡下取18項指標(biāo)（X1、X2、X3、X4、X5、X6、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25），400倍鏡下取7項指標(biāo)（X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13）。以上指標(biāo)均指1個視野下的情況，每項指標(biāo)至少觀察4個視野，取4個視野的平均值作為相應(yīng)指標(biāo)的測量數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

隨機選取人尸體股骨300例和每類動物各30例的股骨相關(guān)數(shù)據(jù)按人與哺乳動物、人與家禽、人與11種動物進行逐步判別分析，并分別建立人與哺乳動物、人與家禽、人與11種動物的判別方程。

利用預(yù)留的驗證樣品（100例人尸體和每類動物各20例）對判別方程的判別能力進行驗證。以上統(tǒng)計應(yīng)用SPSS 14.0軟件包完成。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)

經(jīng)上述切片染色處理后，人和11種常見動物切片在顯微鏡下顯示骨質(zhì)顏色為深黃色，骨單位、骨陷窩和骨小管被染成紫褐色。

牛、馬、豬等大型哺乳動物其哈弗氏系統(tǒng)的面積大小不一，排列不規(guī)則，而且可以見到明顯的叢狀骨，有些可以見到骨單位帶。山羊、綿羊、狗、貓、兔等個體較小的哺乳動物哈弗氏系統(tǒng)形態(tài)有圓形、橢圓形和不規(guī)則形，以橢圓形為主，大小不一，總體較大型動物和人的哈弗氏系統(tǒng)?。粌?nèi)外環(huán)骨板較明顯，但明顯厚薄不均；骨單位帶和叢狀骨較常見，特別是山羊的叢狀骨特別多。

鵝、鴨和雞等家禽的骨單位排列不規(guī)則，骨單位較哺乳動物小，環(huán)層骨板數(shù)量很少，并可見到只有哈弗氏管壁一層環(huán)形骨板的原始骨單位，很少見到叢狀骨和骨單位帶。

人的哈弗氏系統(tǒng)較大，大小較均一，形態(tài)較規(guī)整，排列相對整齊，舊骨單位相對較多，沒有骨單位帶和叢狀骨。

2.2 逐步判別方程的建立

2.2.1 人與哺乳動物

通過逐步判別，選出哈弗氏系統(tǒng)數(shù)量（X1）、哈弗氏系統(tǒng)直徑（X2）、內(nèi)環(huán)骨板厚度（X10）、內(nèi)環(huán)骨板相對厚度（X11）、外環(huán)骨板厚度（X12）、外環(huán)骨板相對厚度（X13）、非哈弗氏管數(shù)量（X14）、骨陷窩數(shù)量（X15）以及骨陷窩面積（X16）9項指標(biāo)建立人與哺乳動物的判別方程：

2.2.2 人與家禽

通過逐步判別，選出哈弗氏系統(tǒng)數(shù)量（X1）、環(huán)層骨板數(shù)量（X4）、內(nèi)環(huán)骨板厚度（X10）、內(nèi)環(huán)骨板相對厚度（X11）、外環(huán)骨板厚度（X12）、外環(huán)骨板相對厚度（X13）、非哈弗氏管數(shù)量（X14）、骨陷窩數(shù)量（X15）以及骨陷窩面積（X16）9項指標(biāo)建立人與家禽的判別方程：

2.2.3 人與11種動物

通過逐步判別分析，選出哈弗氏系統(tǒng)數(shù)量（X1）、哈弗氏系統(tǒng)直徑（X2）［哈弗氏系統(tǒng)面積（X3）］、環(huán)層骨板數(shù)量（X4）、哈弗氏管直徑（X5）［哈弗氏管面積（X6）］、內(nèi)環(huán)骨板厚度（X10）、內(nèi)環(huán)骨板相對厚度（X11）、外環(huán)骨板厚度（X12）、外環(huán)骨板相對厚度（X13）、非哈弗氏管數(shù)量（X14）、骨陷窩數(shù)量（X15）以及骨陷窩面積（X16）11項指標(biāo)建立人與11種動物的判別方程：

2.3 判別效果評價

利用預(yù)留的驗證樣品對判別公式的判別能力進行評價，人與哺乳動物的誤判率為3.7%（即正確判別率為96.3%），人與家禽的誤判率為0%（即正確判別率為100%），人與11種動物的誤判率為10.6%（即正確判別率為89.4%）。

3 討論

不同動物的骨骼都具有適應(yīng)期生存環(huán)境和身體狀況的特點，一般情況下很容易區(qū)分開來，但在公安實際工作中，經(jīng)常會遇到碎骨片需要進行種屬鑒別的情況[4-5]，特別是由于日常生活中的常見動物，其骨骼碎片也常存在于人們的生活環(huán)境中。目前常用的骨骼種屬鑒別方法是用抗原抗體法鑒別骨骼中蛋白質(zhì)的種屬特異性，或者利用DNA檢驗技術(shù)判別動物DNA的種屬特異性，這些方法大多以鑒別是人或動物為目的，而且在陳舊骨骼、焚燒過的骨骼等案件中DNA和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)已經(jīng)消失或被毀壞，無法通過蛋白質(zhì)或DNA檢測技術(shù)進行骨骼種屬的檢驗[6]。

本研究系統(tǒng)觀察和檢驗了人、哺乳動物、家禽三大生物種群的常見股骨組織學(xué)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)在較低等的動物中存在著由只有一層哈弗氏管壁的原始骨單位，而且隨著動物進化等級的降低，這類骨單位的數(shù)量會逐漸增加；而且，在家禽中可以看出，原始骨單位由靠近外環(huán)骨板的位置出現(xiàn)，逐漸向骨髓腔方向靠近，在靠近的過程中其環(huán)層骨板數(shù)量逐漸增多，同時哈弗氏管的管腔直徑逐漸增大，靠近骨髓腔時，哈弗氏管的管腔變得極大，形態(tài)不規(guī)則，逐漸進入到骨髓腔后，管壁變成骨小梁，管腔變成了骨小梁之間的間隙。

從整體來看，股骨組織形態(tài)學(xué)具有明顯的生物進化的特征，主要表現(xiàn)為從人到哺乳動物、再到家禽的骨單位面積越來越小，200倍顯微鏡下的單個視野內(nèi)骨單位數(shù)量越來越多，排列越來越不規(guī)整，骨單位的環(huán)層骨板數(shù)越來越少，在貓、兔及家禽中可以看到由只有一層形成哈弗氏管壁的環(huán)層骨板形成的原始骨單位，而且其數(shù)量也是由貓到雞逐漸增多。而且，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的骨單位帶和叢狀骨只在貓以上的較大型哺乳動物中出現(xiàn)，人和家禽沒有發(fā)現(xiàn)。這些形態(tài)學(xué)差

異表明在生物進化的過程中，股骨組織學(xué)形態(tài)也隨著生物進化的程度而呈現(xiàn)出與之相對應(yīng)的、符合動物進化程度的特征，這也為研究生物進化提供了一個新的領(lǐng)域，并為證明生物進化的程度提供了一個新的證據(jù)。所以，觀察動物骨骼的組織學(xué)形態(tài)，不僅能夠判斷其種屬，還能在一定程度上推斷出其進化程度，對考古學(xué)、法醫(yī)學(xué)的種屬鑒別提供了新的方法和手段，同時也為研究生物進化提供了新的觀察指標(biāo)。

另外，本研究通過骨骼的微觀形態(tài)特征建立的種屬判別方程，可以彌補蛋白質(zhì)、DNA技術(shù)在實際案例中的不足。通過比較人與11個種屬的股骨骨骼微觀形態(tài)，最終篩選出11項有統(tǒng)計學(xué)差異的指標(biāo)，包括哈弗氏系統(tǒng)數(shù)量、哈弗氏系統(tǒng)直徑（哈弗氏系統(tǒng)面積）、環(huán)層骨板數(shù)量、哈弗氏管直徑（哈弗氏管面積）、內(nèi)環(huán)骨板厚度、內(nèi)環(huán)骨板相對厚度、外環(huán)骨板厚度、外環(huán)骨板相對厚度、非哈弗氏管數(shù)量、骨陷窩數(shù)量以及骨陷窩面積，并應(yīng)用這些指標(biāo)建立了人與11個種屬的判別方程。經(jīng)過預(yù)留樣本的驗證，人與11個種屬的判別方程可達到89.4%的正確判別率。通過逐步判別分析，人與哺乳動物、人與家禽均篩選出9項指標(biāo)建立判別方程。其中人與哺乳動物的正確判別率為96.3%，人與家禽的正確判別率可達100%。統(tǒng)計分析認為，本研究建立的種屬判別方程具有良好的判別能力，各組的正確判別率都很高。建議在實際檢案過程中，可以對未知檢材分別進行人與11種動物、人與哺乳動物、人與家禽的判別，根據(jù)三大類判別方程的判別結(jié)果進行綜合判斷未知檢材的種屬屬性。本研究建立的各種屬判別方程能夠滿足實際工作的需要，在遇到無法應(yīng)用蛋白質(zhì)和DNA手段的案件中，可以將本研究的成果加以應(yīng)用。

[1]Owsley DW，Mires AM，Keith MS.Case involving differentiation of deer and human bone fragments[J].J Forensic Sci，1985，30（2）：572-578.

[2]張繼宗，譚祖鑫.法醫(yī)骨組織學(xué)研究[J].刑事技術(shù)，2004，（4）：32-36.

[3]Dittmann K.Histomorphometric study of bonemicrostructure of primates and domestic animal with the goal of species identification with reference to the effects of domestication[J].Anthropol Anz，2003，61（2）：175-188.

[4]張繼宗.骨骼種屬鑒定的組織學(xué)研究[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2001，17（3）：139-141.

[5]張繼宗，趙樹民.燒骨殘片種屬鑒定的研究[J].刑事技術(shù)，2000，（6）：5-6.

[6]郭景元，李伯齡.中國刑事科學(xué)技術(shù)大全：法醫(yī)物證學(xué)[M].北京：中國人民公安大學(xué)出版社，2002：601-610.

Species Identification Based on Morphological Variability of Femur

XIN Cai-rui1,BAI Si2,QIN Zhi-jia3,GAO Jing-shang4,LIN Zi-qing3,CHENG Yi-bin5
（1.Police Junior College of Tibet,Lhasa 850000,China;2.Beijing Shengtang Institute of Forensic Science, Beijing 100039,China;3.Department of Forensic Medicine,National Police University of China,Shenyang 110854,China;4.Institute of Forensic Science,Public Security Department,Tibet Autonomous Region,Lhasa 850000,China;5.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,P.R.China,Shanghai 200063,China）

Objective To study the morphological characteristics of femurs of adult human and 11 kinds of adult animals from cattle,horses,pigs,goats,sheep,dogs,cats,rabbits,geese,ducks,chickens,and to establish an effective species identification method among various species.Methods The 4 cm mid-diaphyseal segment of the femur from adult human（older than 20 years old）at autopsy was obtained.Additionally,the 4 cm ones from 11 kinds of adult animals were obtained.After decalcification,all femurs were made into slices,and then were observed by optical microscope.The 25 indexes were selected and analyzed by step discriminant analysis according to differences between human and mammal,human and poultry,and human and 11 kinds of animals.Results The histological structure of bone mineral density of middle part of femur had obvious characteristics among the species.And the morphology and number of osteon showed the trend of obvious biological evolution.There were 11 indexes with significant differences between human and 11 kinds of animals to establish some mathematical models to discriminate all species.The correct discrimination rate was 96.3%between human and mammal.The correct discrimination rate was up to 100%between human and poultry,and was 89.4%among human,mammal and poultry.Conclusion The mathematical models have good correct discrimination rate among human and the other animals,which could be applied in the practical species identification cases.

forensic anthropology;femur;humans;mammals;poultry;species identification

DF795.6

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.06.004

1004-5619（2015）06-0428-04

2015-05-18）

（本文編輯：高東）（

2015-07-22）

辛彩蕊（1979—），女，講師，主要從事法醫(yī)人類學(xué)、法醫(yī)物證學(xué)科研工作；E-mail：824594866@qq.com

林子清，男，教授，主要從事法醫(yī)物證學(xué)研究和鑒定；E-mail：lziqing2003@sohu.com

通信作者：程亦斌，男，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)臨床學(xué)、法醫(yī)人類學(xué)研究和鑒定；E-mail：chybfy_teacher@hotmail.com