NINJ2基因5'上游單核苷酸多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性①

賴麗瓊，冼文川，陳煜森

NINJ2基因5'上游單核苷酸多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性①

賴麗瓊1，冼文川2，陳煜森2

目的分析粵西地區(qū)漢族人群NINJ2基因5'上游rs11833579G/A、rs4980959C/A單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與腦梗死及亞型的關(guān)聯(lián)性。方法采用聯(lián)合聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)和直接測序方法，對278例腦梗死患者(病例組)和120例正常人(對照組)進行rs11833579G/A和rs4980959C/A多態(tài)位點基因型檢測并進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果病例組rs11833579G/A與rs4980959C/A基因型頻率和等位基因頻率與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。小動脈閉塞型卒中rs4980959C/A位點AA基因型頻率高于對照組(18.3%vs 9.2%,P=0.041)，A等位基因頻率高于對照組(35.4%vs 46.1%,P=0.019)。多元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，rs4980959C/A位點含AA基因型發(fā)生小動脈閉塞型腦梗死的可能性高于G等位基因攜帶者(OR=4.012,95%CI:1.209～14.939，P= 0.027)。結(jié)論NINJ2基因5'上游非編碼區(qū)SNPrs11833579G/A多態(tài)性與缺血性腦卒中無關(guān)；SNPrs4980959C/A的A等位基因是小動脈閉塞型腦梗死的危險因素；AA基因型是小動脈閉塞型的易感基因型。

NINJ2基因；腦梗死；單核苷酸多態(tài)性

[本文著錄格式]賴麗瓊，冼文川，陳煜森.NINJ2基因5'上游單核苷酸多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性[J].中國康復(fù)理論與實踐, 2015,21(3):315-319.

CITEDAS:Lai LQ,Xian WC,Chen YS.Association of NINJ2 gene 5'upstream single-nucleotide polymorphisms with cerebral infarction[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(3):315-319.

腦梗死是一種復(fù)雜的多因素疾病。動脈粥樣硬化、高血壓、高血脂、糖尿病等均是腦梗死的高危因素。全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide Association Study,GWAS)發(fā)現(xiàn)，諸多染色體變異和腦梗死有關(guān)聯(lián)[1]；有研究提示，位于染色體12p13上NINJ2基因的單核苷酸多態(tài)位點(single-nucleotide polymorphisms, SNPs)與腦梗死有關(guān)，但國內(nèi)外研究結(jié)論并不一致[2-4]。我們推測，該相關(guān)性與人群及腦梗死的各亞型

有關(guān)。本研究擬通過聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法結(jié)合直接測序方法分析NINJ2基因5'上游非編碼區(qū)rs11833579G/A和rs4980959C/A兩多態(tài)位點在粵西地區(qū)漢族人中基因頻率和頻率，并探討兩個位點與粵西地區(qū)漢族人腦梗死及亞型的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

病例組為廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2011年7月～2012年3月住院的患者，為粵西地區(qū)漢族人，共278例，均符合1995年全國第四次腦血管病學(xué)術(shù)會議制定的腦梗死標(biāo)準(zhǔn)[5]，并經(jīng)頭部CT和/或磁共振成像(MRI)確診。對照組為同期在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院健康體檢者，為粵西地區(qū)漢族人，共120名，排除腦血管病、冠心病、糖尿病，肝、腎、血液、自身免疫性疾病。病例組和對照組均記錄以下指標(biāo)：年齡、性別、吸煙史、血壓、糖尿病、空腹血糖、甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)。

病例組按照TOAST標(biāo)準(zhǔn)，分為大動脈粥樣硬化性卒中(large-artery atherosclerosis,LAA)、心源性腦栓塞(cardioembolism,CE)、小動脈閉塞性卒中或腔隙性卒中(small-artery occlusion,Lacunar,SAA)、其他原因所致的缺血性卒中(stroke of other determined etiology,SOE)和不明原因的缺血性卒中(stroke of other undetermined etiology,SUE)。因本組資料SOE和SUE樣本量極少，予以剔除。

1.2 方法

1.2.1 相關(guān)多態(tài)性位點的篩選

rs11833579G/A為GWAS研究得出與缺血性腦卒中相關(guān)的位點[2]，rs4980959C/A通過SNPper軟件從公共數(shù)據(jù)庫獲得。選擇本實驗的SNPs根據(jù)是否有合適的限制性內(nèi)切酶、中國人群較小的等位基因頻率大于10%，共選擇2個多態(tài)位點：rs11833579G/A和rs4980959C/A，都位于NINJ2基因5'上游非編碼區(qū)。

1.2.2 血樣本的收集

抽取早晨空腹肘部靜脈血2 ml至含有EDTA-K2的抗凝試管，提取外周血白細(xì)胞的基因組DNA，將提取后剩下的血標(biāo)本-20℃保存。

1.2.3 血糖、血脂水平檢測

利用全自動生化檢測儀測定血糖、膽固醇、甘油三酯、HDL、LDL。

1.2.4 DNA的提取

用溶液法(TIANamp Blood DNA System，北京天根生化科技有限公司)按說明書提取外周血白細(xì)胞的基因組DNA，平均產(chǎn)量約為35 mg/L。

1.2.5 DNA擴增

PCR引物以引物設(shè)計軟件PRIMER 5.0設(shè)計。

rs11833579G/A：上游5'-CCA GCA TTG TGG GAAGT-3'；下游5'-CCC TCTATT CAG CCAGAT-3'

rs4980959C/A：上游5'-GTC TCT GCT GTT TCT TCG-3'；下游：5'-GAT GCT GTC ACT ACC AAC TCA-3'

目的基因的PCR擴增方法如下。rs11833579G/ A：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60.5℃退火30 s，72℃延伸60 s；30個循環(huán)后72℃延伸10 min。rs4980959C/A：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s；30個循環(huán)后72℃延伸10 min。

1.2.6 限制性內(nèi)切酶設(shè)計

根據(jù)片段序列以及多態(tài)性位點，在NEBcutter V2.0(http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)設(shè)計限制性內(nèi)切酶：rs11833579G/A內(nèi)切酶為BtscI，rs4980959C/A內(nèi)切酶為Hpy188I。

1.2.7 擴增產(chǎn)物酶切及基因型分析

rs11833579G/A擴增片段長度為404 bp。雜合子AG基因型經(jīng)BtscI消化后產(chǎn)生3個片段，分別是404 bp、304 bp和100 bp；純合子GG基因型可被BtscI完全消化，顯示片段為304 bp和100 bp；純合子AA基因型無BtscI酶切位點，顯示為PCR產(chǎn)物的404 bp片段。

rs4980959C/A擴增片段長度為218 bp。雜合子AC基因型經(jīng)Hpy188I消化后產(chǎn)生3個片段，分別是218 bp、150 bp和68 bp；純合子CC基因型可被Hpy188I完全消化，顯示片段為150 bp和100 bp；純合子AA基因型無Hpy188I酶切位點，顯示為PCR產(chǎn)物的218 bp片段。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件和遺傳學(xué)數(shù)理統(tǒng)計方法進行統(tǒng)計分析。各組臨床計量資料均以(±s)，計算性別、吸煙、高血壓病、糖尿病、頸動脈彩色多普勒超聲檢查結(jié)果、各組基因型和等位基因頻率，Hardy-Weinburg平衡吻合度和基因頻率統(tǒng)計分析采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，各變量與腦梗死的關(guān)系采

用多元Logistic回歸分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 rs11833579G/A

病例組rs11833579G/A基因型GG、GA、AA頻率與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。病例組等位基因G、A頻率與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

按性別及腦梗死亞型進行分析，無論男性或女性，該位點基因型與等位基因頻率在腦梗死各亞型組與對照組間均無顯著差異(P＞0.05)。見表2。

2.2 rs4980959C/A

病例組rs4980959C/A的基因型CC、CA、AA頻率與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。病例組等位基因C、A頻率與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

按性別及腦梗死亞型進行分析，SAA組AA基因型頻率高于對照組(P=0.041)，CC、CA基因型頻率無顯著性差異(P＞0.05)；A等位基因頻率高于對照組(P= 0.019)。見表4。不論男性或女性，基因型與等位基因頻率病例組各亞型與對照組之間均無顯著性差異(P＞0.05)。見表5。

2.3 多元Logistic回歸分析

以腦梗死為因變量，以性別、吸煙、高血壓病、糖尿病、空腹血糖、膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低高密度脂蛋白、半胱氨酸、病例組rs4980959C/ A基因型AA、小動脈閉塞型rs4980959C/A基因型AA為自變量進行多元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，腦梗死的危險因素有高血壓病、空腹血糖、半胱氨酸、小動脈閉塞型rs4980959C/A基因型AA(P＜0.05)。見表6。

表1 rs11833579G/A多態(tài)性基因型頻率及等位基因頻率[n(%)]

表2 不同性別及腦梗死亞型間rs11833579G/A多態(tài)性基因型頻率及等位基因頻率[n(%)]

表3 rs4980959C/A多態(tài)性基因型頻率及等位基因頻率[n(%)]

表4 不同腦梗死亞型間rs4980959C/A多態(tài)性基因型頻率及等位基因頻率[n(%)]

表5 不同性別及腦梗死亞型間rs11833579G/A多態(tài)性基因型頻率及等位基因頻率[n(%)]

表6 人群中多元Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

NINJ2基因位于染色體12p13.33，包括4個外顯子和3個內(nèi)含子，編碼由142個氨基酸組成的約20 kDa的蛋白質(zhì)，即神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白2(ninjurin 2)[6]。Ninjurin 2是ninjurin家族的一員，初步研究提示ninjurin 2可表達于神經(jīng)系統(tǒng)，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)可介導(dǎo)同種細(xì)胞相互作用，以促進背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的軸突生長；周圍神經(jīng)損害可誘導(dǎo)施萬細(xì)胞上調(diào)表達該蛋白，以促進神經(jīng)突生長和神經(jīng)再生[7]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，ninjurin 2的表達程度可能影響腦對缺血的耐受性；動物研究發(fā)現(xiàn)，在損傷的脊髓中，NINJ2基因轉(zhuǎn)錄表達分析發(fā)現(xiàn)cDNA表達量明顯改變，提示ninjurin 2的蛋白表達水平可能參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性損傷耐受機制[6,8]。NINJ2作為一個評價腦卒中預(yù)后的候選基因，可能能改變腦細(xì)胞對缺血損傷的反應(yīng)[9]。

目前已知約95%的SNP位于非編碼區(qū)。現(xiàn)有卒中GWAS研究提示，染色體12p13上NINJ2基因5'上游非編碼區(qū)兩個SNP與LAA型腦梗死顯著關(guān)聯(lián)，從而使得非編碼區(qū)SNP得到更多關(guān)注[2]。

本研究中，rs11833579G/A位點的基因型與基因頻率與粵西地區(qū)漢族人群缺血性腦卒中無關(guān)聯(lián)，按性別及腦梗死亞型進行分層后，仍然提示兩者之間無關(guān)聯(lián)。Ikram的GWAS初篩研究提示，rs11833579G/A位點A等位基因增加白種人發(fā)生LAA型腦梗死的風(fēng)險1.35倍[2]。Kim等認(rèn)為，rs11833579 A/A或G/A基因型與韓國低齡患者(年齡＜59歲)的首次卒中有關(guān)[10]。國內(nèi)陳廓的研究發(fā)現(xiàn)，該位點GG基因型和G等位基因與中國房山地區(qū)漢族人腦梗死呈強正相關(guān)[11]。Matsushita

等研究表明，在日本人中，rs11833579G/A與LAA型腦梗死及其他亞型均無相關(guān)性[12]。尚賢金等發(fā)現(xiàn)，rs11833579 G/A位點與福建地區(qū)漢族人LAA型腦梗死發(fā)病無關(guān)聯(lián)[13]。

本研究對象rs11833579 G/A次要等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)為34.5%，白種人中MAF為23%[2]，與本研究有顯著性差異(χ2=96.407,P＜0.05)；日本人MAF為42%[12]，與本研究同樣存在顯著性差異(χ2=10.682,P＜0.05)；福建地區(qū)人群MAF為36.4%，與本研究無顯著性差異(χ2=1.574,P＞0.05)。相關(guān)研究結(jié)果不盡一致，可能與人群的遺傳背景有關(guān)，如種族、地區(qū)等；同時樣本量存在差異很大，可能對結(jié)果也有一定的影響[14]。

本研究中，rs4980959C/A位點的基因型與基因頻率與粵西地區(qū)漢族人群缺血性腦卒中無關(guān)聯(lián)。按腦梗死亞型分層，SAA組rs4980959C/A位點AA基因型頻率高于對照組，A等位基因頻率高于對照組。位點rs4980959C/A曾報道其基因與基因型與阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)無相關(guān)性，但rs4980959C/A參與的單倍體型CAGGA可降低AD的患病風(fēng)險[15]。目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)位點rs4980959C/A多態(tài)性與腦梗死關(guān)聯(lián)的報道。

經(jīng)多元Logistic回歸分析，校正了吸煙、血壓、血糖、血脂等傳統(tǒng)危險因素的影響后，AA基因型發(fā)生SAA型腦梗死的風(fēng)險是普通人群的4.012倍。因此，我們推測，NINJ2基因5'上游非編碼區(qū)rs4980959C/A可能通過參與基因調(diào)控影響NINJ2基因的功能，具體機制還不清楚。

此次我們未進行人體內(nèi)ninjurin 2蛋白水平的測定，不能對該基因的功能進行分析。需要進一步研究探索。

[1]Lanktree MB,Dichgans M,Hegele RA.Advances in genomic analysis of stroke:what have we learned and where are we headed?[J].Stroke,2010,41(4):825-832.

[2]Ikram MA,Seshadri S,Bis JC,et al.Genome-wide association studies of stroke[J].N Engl J Med,2009,360(17):1718-1728.

[3]Tong Y,Zhan F,Han J,et al.Lack of association between two key SNPs on chromosome 12p13 and ischemic stroke in Chinese Uyghur population[J].J Neurol Sci,2012,323(1-2): 52-55.

[4]Olsson S,Melander O,Jood K,et al.Genetic variant on chromosome 12p13 does not show association to ischemic stroke in 3 Swedish case-control studies[J].Stroke,2011,42(1): 214-216.

[5]中華神經(jīng)科學(xué)會.各類腦血管疾病診斷要點[J].中華神經(jīng)科雜志,1996,29(6):379-380.

[6]Araki T,Milbrandt J.Ninjurin2,a novel homophilic adhesion molecule,is expressed in mature sensory and enteric neurons and promotes neurite outgrowth[J].Neurosci,2000,20(1): 187-195.

[7]Araki T,Milbrandt J.Ninjurin，a novel adhesion molecule,is induced by nerve injury and promotes axonal growth[J].Neuron,1996,17(2):353-361.

[8]Dimou L,Schnell L,Montani L,et al.Nogo-A-deficient mice reveal strain-dependent differences in axonal regeneration[J].J Neurosci,2006,26(21):5591-5603.

[9]Hsieh YC,Seshadri S,Chung WT,et al.Association between genetic variant on chromosome 12p13 and stroke survival and recurrence:a one year prospective study in Taiwan[J].J Biomed Sci,2012,19(1):2-8.

[10]Kim DE,Noh SM,Jeong SW,et al.NINJ2 SNP may affect the onset age of first-ever ischemic stroke without increasing silent cerebrovascular lesions[J].BMC Res Notes,2012,5:155.

[11]陳廓,肖占森,侯淑琴,等.NINJ2基因多態(tài)性與房山地區(qū)漢族腦卒中易感強相關(guān)[J].北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2010,42(5): 498-502.

[12]Matsushita T,Umeno J,Hirakawa Y,et al.Association study of the polymorphisms on chromosome 12p13 with atherothrombotic stroke in the Japanese population[J].Hum Genet, 2010,55(7):473-476.

[13]尚賢金,王檸,吳志英.染色體12p13兩基因間多態(tài)與腦梗死的關(guān)聯(lián)研究[D].福州:福建醫(yī)科大學(xué),2011.

[14]Ding H,Tu X,Xu Y,et al.No evidence for association of 12p13 SNPs rs11833579 and rs12425791 within NINJ2 gene with ischemic stroke in Chinese Han population[J].Atherosclerosis,2011,216(2):381-382.

[15]Lin KP,Chen SY,Lai LC,et al.Genetic polymorphisms of a novel vascular susceptibility gene,ninjurin2(NINJ2),are associated with a decreased risk of Alzheimer’s disease[J].PLoS ONE,2001,6(6):1-7.

Association of NINJ2 Gene 5'Upstream Single-nucleotide Polymorphisms with Cerebral Infarction

LAI Li-qiong1,XIAN Wen-chuan2,CHEN Yu-sen2
1.Department of Neurology,Xiangdong Hospital,Hunan Normal University,Liling,Hunan 412200,China;2.Department of Neurology,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang,Guangdong 524001,China

Objective To investigate the relationship between cerebral infarction(CI)and the single-nucleotide polymorphisms(SNPs) of rs11833579G/A and rs4980959C/A of NINJ2 gene in Han population of the Western Guangdong province in China.Methods Genotype and allele frequency of rs11833579G/A and rs4980959C/A were analyzed in 278 cerebral infarction patients and 120 healthy controls.Results There was insignificant difference in frequencies of genotypes and allele in two polymorphisms(rs11833579 G/A and rs4980959C/A) of NINJ2 gene between CI and control groups(P＞0.05).AAgenotype frequency of rs4980959C/Awas more in patients with small-artery occlusion(SAA)than in the control group(18.3%vs 9.2%,P=0.041),while the A allele frequency was more in the patients with SAA than in the control group(35.4%vs 46.1%,P=0.019).Logistic regression analysis indicated that AA genotypes of rs4980959C/A was a risk factor for SAA over G allele carriers(OR=4.012,95%CI:1.209～14.939,P=0.027).Conclusion NINJ2 gene 5'upstream untranslated region SNPrs11833579G/A polymorphism does not associate with the risk of ischemic stroke.NINJ2 gene 5'upstream untranslated region SNPrs4980959C/AAallele is a risk factor for SAA,AAgenotype is a susceptible genotype for SAA.

NINJ2 gene;cerebral infarction;single-nucleotide polymorphisms

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.03.017

R743.3

A

1006-9771(2015)03-0315-05

2014-10-09

2014-11-17)

廣東醫(yī)學(xué)院青年基金項目(No.XQ1016)。

1.湖南師范大學(xué)附屬湘東醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南醴陵市412200；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東湛江市524001。作者簡介：賴麗瓊(1983-)，女，漢族，湖南株洲市人，碩士，醫(yī)師，主要研究方向：腦血管病。通訊作者：陳煜森，男，主任醫(yī)師，主要研究方向：腦血管病及神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。E-mail:chenyusen925@163.com。