刺血療法對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠局部抗炎因子的影響①

呂凱露，夏有兵,，程潔，穆艷云，朱冰梅，羅璽，梁莎，莊克清

刺血療法對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠局部抗炎因子的影響①

呂凱露1，夏有兵1,2，程潔1，穆艷云1，朱冰梅1，羅璽2，梁莎3，莊克清1

目的探討刺血療法治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)抗炎分子機(jī)制。方法60只Sprague-Dawley大鼠等分為正常組、正常刺血組、假手術(shù)組、模型組、刺血組、藥物組。右踝關(guān)節(jié)腔注射尿酸鈉建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型。藥物組以布洛芬灌胃治療，正常刺血組和刺血組在右側(cè)昆侖穴點刺放血。治療前后測量各組大鼠踝關(guān)節(jié)周徑。用RT-PCR法和Western blotting法檢測大鼠踝關(guān)節(jié)白細(xì)胞介素(IL)-10、IL-4 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果治療后刺血組較正常組踝關(guān)節(jié)周徑增大(P＜0.05)，較模型組、藥物組周徑減小(P＜0.05)。刺血組較正常組、模型組、藥物組踝關(guān)節(jié)IL-10 mRNA的相對表達(dá)量升高(P＜0.05)，較正常組、模型組IL-10蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)；刺血組踝關(guān)節(jié)IL-4 mRNA和蛋白表達(dá)較正常組有升高趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論刺血療法通過促進(jìn)局部IL-10表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，可能是其治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制之一。

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；刺血療法；白細(xì)胞介素-10；白細(xì)胞介素-4；炎癥

[本文著錄格式]呂凱露，夏有兵，程潔，等.刺血療法對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠局部抗炎因子的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2015,21(3):276-279.

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痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是一種由關(guān)節(jié)內(nèi)尿酸結(jié)晶介導(dǎo)的炎癥性關(guān)節(jié)炎，多與高尿酸血癥有關(guān)，易反復(fù)發(fā)作，若得不到有效治療，極易致殘、致畸，影響關(guān)節(jié)功能[1-2]。現(xiàn)有治療皆有不同程度的副反應(yīng)[3-4]。近年臨床報道，刺血療法治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎起效快、療效佳、副作用少[5-8]。我們以往實驗研究結(jié)果也證實，刺

血療法能有效快速地減輕關(guān)節(jié)腔尿酸鈉的沉積，減少炎細(xì)胞的浸潤，改善關(guān)節(jié)軟骨的超微結(jié)構(gòu)，改善局部癥狀及功能活動[9]。有研究表明，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與其局部促炎和抗炎細(xì)胞因子的失衡有關(guān)[10]。本研究運(yùn)用刺血療法治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠[11]，觀察關(guān)節(jié)內(nèi)抗炎因子白介素10(interleukin-10, IL-10)、白介素4(interleukin-4,IL-4)的mRNA和蛋白表達(dá)變化，探討刺血療法治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)抗炎分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康SPF級Sprague-Dawley大鼠60只，雄性，體重(200±20)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK(京)2012-0001。每籠5只合籠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實驗動物中心，室溫22～25℃，12/12 h晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食與飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將大鼠編號，用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組(N組)、正常刺血組(BN組)、假手術(shù)組(S組)、模型組(UA組)、刺血組(B組)、藥物組(I組)，每組10只。實驗過程中對動物的處置遵循相關(guān)動物倫理學(xué)要求。

1.2 主要試劑及儀器

尿酸鈉：SIGMA公司。布洛芬混懸液：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。IL-10抗體、IL-4抗體、β-actin抗體：ABCAM公司。HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗：CST公司。化學(xué)發(fā)光底物、SYBR Green：THERMO公司。Trizol試劑：INVITROGEN公司。第一鏈cDNA合成試劑盒：ROCHE公司。IL-10基因引物、IL-4基因引物、GAPDH基因引物：上海捷瑞生物工程有限公司。

MIKRO220/220R低溫高速離心機(jī)：HETTICH公司。紫外分光光度儀：JENWAY公司。垂直電泳儀，垂直、轉(zhuǎn)印電泳槽：BIO-RAD公司?；瘜W(xué)發(fā)光成像儀：上海BIOSHINE公司。Nano微量分光光度計、分子雜交PCR儀：THERMO公司。Mx3000P實時熒光定量PCR儀：STRATAGENE公司。

1.3 造模方法

稱取尿酸鈉0.2 g，充分研磨，加入無菌生理鹽水4 ml，制成5%尿酸鈉混懸液備用。大鼠10%水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉。N組、BN組不手術(shù)；UA組、B組、I組大鼠將右后肢踝關(guān)節(jié)擺放成直角，充分暴露踝關(guān)節(jié)與脛腓骨之間的間隙，75%酒精局部皮膚消毒，4號針頭以45°角從該間隙插入右后肢背側(cè)正中踝關(guān)節(jié)與脛腓骨之間的關(guān)節(jié)腔，注入5%尿酸鈉溶液50 μl。大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)腫脹，關(guān)節(jié)活動受限，提示造模成功。S組注入生理鹽水50 μl。

1.4 干預(yù)方法

B組于造模后6 h、24 h固定患肢，在右側(cè)昆侖穴(后肢外踝與跟腱之間的凹陷中)[12]用0.7 mm注射器針頭點刺放血，深度約0.3 cm，以污血放盡為度；BN組以與B組相同的方式點刺放血，以自然停止出血為度；N組于麻醉后6 h、24 h固定右后肢5 min；S組、UA組分別于造模后6 h、24 h固定患肢5 min；I組于造模后6 h、24 h予布洛芬120 mg/kg灌胃。

1.5 標(biāo)本采集

造模后48 h，頸椎脫臼法處死大鼠，迅速打開大鼠右后肢脛跗關(guān)節(jié)，以眼科剪剪切軟骨及周圍肌肉組織，10%PBS快速洗滌，凍存于1.5 ml凍存管內(nèi)，保存于-80℃冰箱備用。

1.6 檢測方法

1.6.1 踝關(guān)節(jié)周徑測量

各組在造模后6 h(治療前)、48 h(治療后)分別用長2～3 mm的紙條測量造模踝關(guān)節(jié)周徑，每個時間點重復(fù)測量3次，取平均值[13]。

1.6.2 踝關(guān)節(jié)IL-10、IL-4 mRNA表達(dá)

組織用液氮磨碎后，Trizol試劑提取總RNA，氯仿和異丙醇抽提。微量分光光度計和瓊脂糖電泳鑒定RNA濃度和純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃凍存?zhèn)溆?。取cDNA 2 μl行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以GAPDH作為內(nèi)參。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s。循環(huán)40次。用自帶軟件系統(tǒng)得出相對應(yīng)的Ct值，計算每個樣本的△Ct，以及樣本的△Ct值和樣本所在組的△Ct均值之差(△△Ct)，△△Ct進(jìn)行乘冪運(yùn)算得到Fold change值作為目的基因的mRNA相對表達(dá)量。具體序列及擴(kuò)增長度如下。

IL-10：上游CCT CTG GAT ACA GCT GCG AC；下游AGTAGATGC CGG GTG GTT CA；長201 bp。

IL-4：上游CTT GCT GTC ACC CTG TTC TGC TT；下游TTC TCC GTG GTG TTC CTT GTT G；長176 bp。

GAPDH：上游GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAT G；下游ATG GTG GTG AAG ACG CCA GTA；長143 bp。

1.6.3 踝關(guān)節(jié)IL-10、IL-4蛋白表達(dá)

組織用液氮磨碎，加入裂解液勻漿，低溫高速離心機(jī)4℃、10000 r/min離心5 min，上清液為總蛋白提取物。用BCA法測定蛋白濃度。將每份蛋白定量為30 μg，上樣20 μl，70/130 V電泳約2 h，轉(zhuǎn)膜液中以300 mA 2 h電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；取下PVDF膜，PBST洗膜，置5%BSA中室溫封閉1.5 h；選擇相應(yīng)的大小范圍的條帶加一抗(1∶3000)中，4℃搖床過夜；PBST洗膜后加二抗(1∶6000)，室溫?fù)u床緩慢搖動2 h；PBST洗膜，化學(xué)發(fā)光底物發(fā)光，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，相應(yīng)軟件分析系統(tǒng)測定目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值的比值作為該蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 踝關(guān)節(jié)周徑

和N組比較，S組和BN組踝關(guān)節(jié)周徑未見增大(P＞0.05)。而治療前后UA組、B組、I組踝關(guān)節(jié)周徑均增大(P＜0.05)。和UA組比較，治療后B組、I組踝關(guān)節(jié)周徑減少(P＜0.05)，且B組小于I組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組踝關(guān)節(jié)周徑的比較(mm)

2.2 踝關(guān)節(jié)IL-10、IL-4 mRNA表達(dá)

B組IL-10 mRNA相對表達(dá)量較N組、UA組、I組升高(P＜0.05)。各組踝關(guān)節(jié)IL-4 mRNA相對表達(dá)量無顯著性差異(P＞0.05)，但兩兩比較時，UA組踝關(guān)節(jié)IL-4 mRNA相對表達(dá)量較N組、BN組、I組升高(P＜0.05)。見表2。

2.3 踝關(guān)節(jié)IL-10、IL-4蛋白表達(dá)

N組、BN組和S組踝關(guān)節(jié)IL-10、IL-4蛋白表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。UA組、B組、I組踝關(guān)節(jié)IL-10蛋白升高(P＜0.05)，B組高于UA組(P＜0.05)。UA組、I組踝關(guān)節(jié)IL-4蛋白表達(dá)較N組升高(P＜0.05)，UA組還較BN組、S組升高(P＜0.05)。見表3。

表2 各組踝關(guān)節(jié)IL-10、IL-4 mRNA表達(dá)比較(2△△Ct)

表3 各組踝關(guān)節(jié)IL-10、IL-4蛋白表達(dá)比較

3 討論

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是尿酸鈉沉積后引起的關(guān)節(jié)軟骨破壞、滑膜產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅腫熱痛[14]。中醫(yī)認(rèn)為，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病關(guān)鍵是血中瘀熱。刺血療法遵循“血有余，則瀉其盛經(jīng)出其血”的原則，具有清熱、止痛、消腫、祛瘀的治療作用。

IL-10作為一種抗炎細(xì)胞因子，主要生理功能為抑制中性粒細(xì)胞[15]。Murakami等認(rèn)為，IL-10過表達(dá)可能會對尿酸鈉結(jié)晶誘導(dǎo)的急性炎癥起抗炎效果[16]。IL-10主要通過抑制炎性細(xì)胞因子、趨化因子和花生四烯酸代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用。Verhoef等認(rèn)為，IL-10可促使Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th2細(xì)胞，亦可提高Ⅰ型膠原蛋白的合成水平，對關(guān)節(jié)軟骨有保護(hù)和修復(fù)

作用[17]。

本研究顯示，刺血治療后，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠局部關(guān)節(jié)IL-10的mRNA和蛋白表達(dá)量明顯高于正常組和模型組，發(fā)揮抗炎作用。

IL-4是由Th2細(xì)胞和肥大細(xì)胞分泌的抗炎因子，能抑制IL-1、IL-6、IL-8等炎性細(xì)胞因子合成，并能在mRNA水平上阻斷單核細(xì)胞、CD4+或CD8+T細(xì)胞[18]。本研究顯示，刺血組踝關(guān)節(jié)IL-4雖有升高的趨勢，但無顯著性。文獻(xiàn)報道，在其他關(guān)節(jié)炎治療中，IL-4局部抗炎作用的發(fā)揮多需治療5 d或以上[19-21]。我們推測B組IL-4表達(dá)不高與作用時間不足(48 h)有關(guān)。有待進(jìn)一步研究。

我們以往研究證實，刺血療法清熱、祛瘀、消腫、止痛的作用適用于急性炎癥反應(yīng)。本研究顯示，刺血療法的清熱、祛瘀、消腫、止痛作用可能是通過上調(diào)抗炎因子IL-10的表達(dá)實現(xiàn)的。

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Effects of Pricking Bloodletting Therapy on Local Anti-inflammatory Cytokine in Rats with Acute Gouty Arthritis onAnkle

Lü Kai-lu1,XIA You-bing1,2,CHENG Jie1,MU Yan-yun1,ZHU Bing-mei1,LUO Xi2,LIANG Sha3,ZHUANG Ke-qing1
1.Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing,Jiangsu 210023,China;2.Nanjing Medical University,Nanjing,Jiangsu 210029,China;3.Hunan University of Medicine,Huaihua,Hunan 418000

Objective To explore the anti-inflammatory of pricking blood therapy in acute gouty arthritis rats.Methods 60 Sprague-Dawley rats were equally divided into normal group,bloodletting normal group,sham group,arthritis group,bloodletting group and ibuprofen group.The acute gouty arthritis model was established with injecting uric acid sodium salt into the right ankle joint cavity. The ibuprofen group was administrated with ibuprofen intragastrically,the bloodletting normal group and bloodletting group were pricked the right Kunlun(BL60)acupoint.The cross section diameter of the right ankle joint were measured before and after treatment.Levels of mRNA and protein of interleukin(IL)-10 and IL-4 expressed in ankle were determined with RT-PCR and Western blotting Results The cross section diameter increased in the bloodletting group compared with the normal group after treatment(P＜0.05),and decreased(P＜0.05)compared with the arthritis group and the ibuprofen group,while the expression of IL-10 mRNA increased(P＜0.05)compared with the normal group,the arthritis group and the ibuprofen group,as well as the IL-10 protein compared with the normal group and the arthritis group(P＜0.05).The expression of IL-4 mRNA and protein increased without significance(P＞0.05)in the bloodletting group compared with the normal group.Conclusion IL-10 may play a role of anti-inflammatory in pricking bloodletting therapy for acute gouty arthritis.

acute gouty arthritis;pricking bloodletting therapy;interleukin-10;interleukin-4;inflammatory

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.03.008

R589.7

A

1006-9771(2015)03-0276-04

2014-12-16

2015-02-05)

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81273840)。

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京市210023；2.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京市210029；3.湖南醫(yī)藥學(xué)院，湖南懷化市418000。作者簡介：呂凱露(1991-)，女，漢族，浙江永康市人，碩士研究生，主要研究方向：針灸流派研究、刺血療法的機(jī)制研究。通訊作者：夏有兵。E-mail: xyb@njmu.edu.cn。