人HSP75基因重組腺病毒載體構(gòu)建及在C17.2神經(jīng)干細(xì)胞的表達(dá)①

王艷，陳慶狀，蔣德旗，李明星，賈思遠(yuǎn)，朱寧，王勇

人HSP75基因重組腺病毒載體構(gòu)建及在C17.2神經(jīng)干細(xì)胞的表達(dá)①

王艷1a，陳慶狀2，蔣德旗1a，李明星1a，賈思遠(yuǎn)1b，朱寧3，王勇1a

目的構(gòu)建HSP75基因重組腺病毒載體，觀察HSP75蛋白在C17.2神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)。方法采用PCR方法從含人HSP75基因質(zhì)粒中擴(kuò)增HSP75基因，連接到腺病毒穿梭質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pHBAd-MCM-HSP75-GFP，在LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑的介導(dǎo)下與腺病毒輔助骨架質(zhì)粒pHBAd-BHGloxΔE1,3 Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，整合包裝成重組腺病毒，TCID50法測(cè)定病毒滴度。使用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀和Western blotting觀察重組腺病毒在C17.2細(xì)胞中的感染情況及HSP75蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果通過酶切鑒定、測(cè)序、PCR鑒定，HSP75基因已正確插入穿梭質(zhì)粒中，并與病毒骨架質(zhì)粒整合包裝成重組腺病毒；重組腺病毒滴度為1.0×1010PFU/ml；Western blotting檢測(cè)，轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)HSP75蛋白。結(jié)論HSP75重組腺病毒載體成功構(gòu)建，對(duì)C17.2神經(jīng)干細(xì)胞具有較高的表達(dá)效力。

熱休克蛋白75；重組腺病毒載體；C17.2神經(jīng)干細(xì)胞

[本文著錄格式]王艷，陳慶狀，蔣德旗，等.人HSP75基因重組腺病毒載體構(gòu)建及在C17.2神經(jīng)干細(xì)胞的表達(dá)[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(3):264-268.

CITED AS:Wang Y,Chen QZ,Jiang DQ,et al.Construction of adenovirus vector carrying human HSP75 gene and expressing in C17.2 neural stem cells[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(3):264-268.

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是以認(rèn)知功能進(jìn)行性下降和情感障礙為特點(diǎn)的神經(jīng)退行性疾病，臨床上早期主要表現(xiàn)為記憶力減退、生活自理能力下降，最終導(dǎo)致進(jìn)行性認(rèn)知功能缺失、生活自理能力完全喪失和神經(jīng)行為異常[1-2]。其中β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)介導(dǎo)的炎性反應(yīng)導(dǎo)致腦內(nèi)微環(huán)

境改變是AD主要的原因之一[3-5]。線粒體是炎性因子損傷的主要靶點(diǎn)[6-7]，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞線粒體成為治療AD的重要途徑。

神經(jīng)干細(xì)胞具有自我維持和更新、分裂增殖和多向分化的潛能[8-9]。干細(xì)胞移植是近幾年來治療神經(jīng)退行疾病的重要手段，特別是對(duì)AD的康復(fù)治療頗具前景[10]。熱休克蛋白75(heat shock protein 75,HSP75)是主要定位于線粒體的伴侶蛋白[11]，參與了多種生理功能的調(diào)控，包括細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖、線粒體合成及胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)等，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮了重要的作用[12-13]。本研究構(gòu)建HSP75基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞，為基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞移植治療AD提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

含HSP75基因的質(zhì)粒、穿梭質(zhì)粒pHBAd-MCMV-GFP、骨架質(zhì)粒pHBAd-BHGloxΔE1,3 Cre、LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑、HEK293細(xì)胞、PCR引物均購(gòu)自漢恒生物科技有限公司。C17.2神經(jīng)干細(xì)胞由上海交通大學(xué)金衛(wèi)林教授饋贈(zèng)。大腸桿菌菌株DH5α購(gòu)自TIANGEN公司。限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA ladder購(gòu)自FERMENTAS公司。DMEM、胎牛血清、馬血清購(gòu)于GIBCO公司。質(zhì)粒DNA抽提試劑盒購(gòu)于康為世紀(jì)公司。凝膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司。HSP75多克隆抗體、nestin小鼠單克隆抗體購(gòu)自ABCAM公司。β-actin小鼠單克隆抗體購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 人HSP75基因的擴(kuò)增

取含人HSP75基因的質(zhì)粒0.5μl為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物5'-ACA CGG ATC CAT GGC GCG CGA GCT GCG GGC GC-3'；下游引物5'-ACA CGA ATT CTC AGT GTC GCT CCA GGG CC-3'，由漢恒生物科技公司合成。循環(huán)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸90 s，循環(huán)25次，72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3 重組穿梭質(zhì)粒pHBAd-MCMV-HSP75-GFP的構(gòu)建與鑒定

HSP75的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和穿梭質(zhì)粒pHBAd-MCMV-GFP分別經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切，回收相應(yīng)片段，經(jīng)T4DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選氨芐青霉素陽性克隆。獲得的菌液進(jìn)行酶切鑒定，將酶切鑒定正確的pHBAd-MCMV-HSP75-GFP質(zhì)粒送公司測(cè)序。

1.4 重組腺病毒的制備、鑒定及滴度測(cè)定

用質(zhì)粒抽提試劑盒提取菌液中的重組穿梭質(zhì)粒。將重組穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒pHBAd-BHGloxΔE1,3 Cre通過LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞大部分病變并從底部脫落進(jìn)行收毒。液氮及37℃水浴反復(fù)凍融3次，離心收集病毒上清液作為第1代毒種(P1)，將P1病毒感染HEK293細(xì)胞再次進(jìn)行擴(kuò)增，收集病毒上清液保存于-80℃。取病毒50μl，加入蛋白酶K 2μl，56℃溫育1 h，煮沸10 min，冰?。蝗?μl為模板行PCR鑒定。采用TCID50法測(cè)定病毒滴度。

1.5 神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

C17.2神經(jīng)干細(xì)胞置于含10%胎牛血清、5%馬血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。收集C17.2細(xì)胞懸液，接種在經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片上，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%時(shí)，4%多聚甲醛固定，10%山羊血清封閉，滴加nestin一抗過夜孵育。次日，依次滴加FITC山羊抗小鼠IgG二抗和DAPI室溫孵育，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 重組腺病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞和HSP75蛋白的表達(dá)檢測(cè)

將C17.2細(xì)胞以2×105/孔接種于六孔板，置于5% CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，12 h后去除培養(yǎng)基，PBS洗2次，添加感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為100的病毒液和無血清DMEM高糖培養(yǎng)基1 ml，2 h后換含10%胎牛血清、5%馬血清的DMEM高糖培養(yǎng)基2 ml繼續(xù)培養(yǎng)。36 h后，用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察GFP表達(dá)情況和病毒感染率。用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞，離心后取上清，BCA法測(cè)蛋白質(zhì)含量，10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉液封閉；加HSP75多克隆抗體和β-actin小鼠單克隆抗體，加辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗，ECL法顯色后掃描。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 人HSP75基因擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物鑒定

在2100 bp處可見特異性片段，大小與目的片段預(yù)期相符(圖1)。

2.2 重組穿梭質(zhì)粒pHBAd-MCMV-HSP75-GFP的鑒定

得到5300 bp和2100 bp左右兩條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致，該質(zhì)粒鑒定正確。測(cè)序結(jié)果與目的序列完全匹配。

2.3 重組腺病毒的鑒定及滴度測(cè)定

以重組腺病毒原液為模板進(jìn)行PCR，2100 bp處能夠擴(kuò)增出預(yù)期條帶(圖1)。采用TCID50進(jìn)行滴度測(cè)定，病毒的滴度為1.0×1010PFU/ml。

2.4 C17.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

C17.2細(xì)胞在普通顯微鏡下，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈扁平的形態(tài)，細(xì)胞邊界不清，并與鄰近的細(xì)胞相互接觸，多次傳代后細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)無明顯改變(圖2)。行nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，全部細(xì)胞均呈nestin抗原陽性(圖2)。

2.5 重組腺病毒對(duì)C17.2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和HSP75蛋白的表達(dá)

熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)，證實(shí)大部分細(xì)胞已被病毒感染(圖3)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)腺病毒轉(zhuǎn)染率，感染率85%左右(圖4)。Ad-HSP75-GFP感染組與正常組(Normal)和Ad-GFP處理組相比，Ad-HSP75-GFP組的HSP75蛋白表達(dá)量增加(P＜0.05)(圖5)。

3 討論

HSP75基因是調(diào)控線粒體功能的關(guān)鍵基因，它除了參與線粒體內(nèi)相關(guān)蛋白的合成轉(zhuǎn)運(yùn)外，還能通過參與調(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，降低對(duì)細(xì)胞的損害[14]。因此HSP75基因成為治療與線粒體疾病密切相關(guān)的AD[15]的重要研究方向。

我們前期研究表明，腦內(nèi)Aβ介導(dǎo)的炎性反應(yīng)影響了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[16]，移植外源性神經(jīng)干細(xì)胞是治療AD的策略之一。本研究選取C17.2神經(jīng)干細(xì)胞作為HSP75基因轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞，該細(xì)胞適合作為基因治療的載體細(xì)胞，特別適用于神經(jīng)退行性疾病的干細(xì)胞移植治療[17-19]。

基因治療載體可分為非病毒載體和病毒載體兩大類。非病毒載體主要以質(zhì)粒載體為代表。質(zhì)粒載體在陽離子型脂質(zhì)體的輔助下進(jìn)入靶細(xì)胞，操作雖然簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)染效率較低、對(duì)細(xì)胞的毒性較大。腺病毒載體是目前應(yīng)用最為廣泛的基因治療載體，它對(duì)分裂期細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞均具有感染能力。它通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，將腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組[20]。目前已有重組腺病毒載體與干細(xì)胞的相關(guān)研究[21-22]。

圖1 重組腺病毒構(gòu)建過程的鑒定

圖2 C17.2神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和免疫鑒定(200×)

圖3 轉(zhuǎn)染后干細(xì)胞GFP表達(dá)(熒光顯微鏡,100×)

圖4 重組腺病毒在C17.2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率

圖5 HSP75蛋白表達(dá)

由于干細(xì)胞是相對(duì)靜止的細(xì)胞，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率較低，毒性也較大。本研究采用MICROBIX公司由Frank L Graham教授建立的高轉(zhuǎn)染效率、低毒性的AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)。將攜帶HSP75質(zhì)粒和攜帶了腺病毒大部分基因組的輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，利用重組酶系統(tǒng)產(chǎn)生重組腺病毒，不經(jīng)純化的病毒滴度可達(dá)1010PFU/ml，足以用來感染靶細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，構(gòu)建的重組腺病毒轉(zhuǎn)染C17.2神經(jīng)干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率較高；Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HSP75基因的神經(jīng)干細(xì)胞可以有效表達(dá)HSP75蛋白。

HSP75基因重組腺病毒的成功構(gòu)建，為闡明AD的病理機(jī)制和基因治療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在后續(xù)干細(xì)胞移植治療AD研究中將進(jìn)一步探討。

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Construction ofAdenovirus Vector Carrying Human HSP75 Gene and Expressing in C17.2 Neural Stem Cells

WANG Yan,CHEN Qing-zhuang,JIANG De-qi,LI Ming-xing,JIA Si-yuan,ZHU Ning,WANG Yong
1.a.Department of Pharmacy;b.Department of Burns,Zhujiang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong 510282,China;2.Department of Pharmacy,Guangzhou Hospital of Integrated Traditional and West Medicine,Guangzhou,Guangdong 510800,China;3.Department of Pharmacy,the Third People's Hospital of Nanhai, Foshan,Guangdong 528244,China

Objective To construct recombinant adenovirus vector carrying the human HSP75 gene and detect its expression in C17.2 neural stem cells.Methods HSP75 gene was amplified from plasmid carrying the human HSP75 gene and inserted to the polyclonal site of adenovirus shuttle plasmid pHBAd-MCMV-GFP.HEK293 cells were co-transfected with the constructed recombinant shuttle plasmid pHBAd-MCMV-HSP75-GFP and large adenovirus helper plasmid pHBAd-BHGloxΔE1,3 Cre in mediation of LipofiterTM.The recombinant adenovirus was obtained and the viral titer was examined using the method of TCID50.The transfection and expression of HSP75 was detected by fluorescence microscope,flow cytometer and Western blotting.Results Restriction digestion,sequencing analysis and PCR amplification revealed the successful construction of recombinant shuttle plasmid and recombinant adenovirus.The titer of recombinant adenovirus was 1.0×1010PFU/ml.Western blotting indicated HSP75 gene could be expressed effectively in neural stem cells after transfection.Conclusion The recombinant adenovirus vector carrying HSP75 gene was successfully constructed and can be expressed after transfected in C17.2 neural stem cells.

heat shock protein 75;recombinant adenovirus vector;C17.2 neural stem cells

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.03.005

R741

A

1006-9771(2015)03-0264-05

2014-12-09

2015-02-16)

1.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30973162)；2.廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.S2012010008199；No.S2013010015546)。

1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，a.藥劑科；b.燒傷科，廣東廣州市510282；2.廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，廣東廣州市510800；3.南海區(qū)第三人民醫(yī)院藥劑科，廣東佛山市528244。作者簡(jiǎn)介：王艷(1989-)，女，漢族，廣東河源市人，碩士研究生，主要研究方向：阿爾茨海默病的基礎(chǔ)研究。通訊作者：王勇，男，博士，教授。E-mail:yongwh2005@163.com。