時鐘基因啟動子甲基化頻率隨增齡的組織特異性改變①

祝艷秋，陸璐，李林，蔡彥寧，張?zhí)m

時鐘基因啟動子甲基化頻率隨增齡的組織特異性改變①

祝艷秋1a，陸璐1a，李林1a，蔡彥寧1b，張?zhí)m1a

目的探索時鐘基因啟動子甲基化頻率增齡性改變及其在衰老中的作用。方法4月齡(青年組，n=9)、20月齡(老年組，n=10)C57BL小鼠，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測小鼠胃、脾、血管、腎、紋狀體中時鐘基因Per1/2、Bmal1/2、Cry1/2、Clock、Npas2啟動子甲基化水平。結(jié)果老年組脾組織Cry1、Bmal2和NPas2啟動子區(qū)甲基化頻率高于青年組(P＜0.05)，胃組織Per1基因啟動子甲基化頻率低于青年組(P＜0.05)，血管組織Bmal1啟動子區(qū)甲基化頻率高于青年組(P＜0.05)。結(jié)論多種時鐘基因啟動子甲基化可能參與衰老進程，并具有組織特異性。

衰老；晝夜節(jié)律；時鐘基因；啟動子甲基化

[本文著錄格式]祝艷秋，陸璐，李林，等.時鐘基因啟動子甲基化頻率隨增齡的組織特異性改變[J].中國康復(fù)理論與實踐, 2015,21(5):514-518.

CITED AS:Zhu YQ,Lu L,Li L,et al.Tissue-specific changes of clock DNA promoter methylation with aging[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(5):514-518.

晝夜節(jié)律是生物體內(nèi)廣泛存在的一種生命時鐘，其周期約為24 h，它可以在分子生物學(xué)、生理學(xué)水平對大腦及外周等各種器官組織功能產(chǎn)生影響。研究顯示，衰老能夠?qū)е聲円构?jié)律異常，包括活動高峰幅度降低以及節(jié)律丟失；時鐘基因表達及功能紊亂也影響衰老相關(guān)疾病，如老年健康女性發(fā)生晝夜活動節(jié)律減少，此類節(jié)律的延后將增加其患癡呆癥和輕度認知障礙的風險，增加其死亡風險[1-3]。

晝夜節(jié)律由多種時鐘基因，如Per1/2、Cry1/2、 Clock、Npas2、Bmal1/2等控制[4]。時鐘基因具有節(jié)奏性的表達由相互關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄反饋/前饋回路產(chǎn)生，從而驅(qū)動生理和行為節(jié)律[5-6]。時鐘基因DNA啟動子CpG島區(qū)域甲基化是基因轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)控方法之一。有研究證實，時鐘基因啟動子甲基化水平升高能抑制基因表達[7]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，衰老相關(guān)疾病患者體內(nèi)存在部分時鐘基因甲基化異常，如帕金森病患者體內(nèi)Npas2基因啟動子甲基化水平顯著降低[8-9]。

以前的研究證實，在C57小鼠組織中存在多種時

鐘基因啟動子的甲基化[10]。本研究觀察C57衰老小鼠不同組織時鐘基因啟動子甲基化的增齡性改變，探索時鐘基因啟動子甲基化在衰老過程中的作用，以及時鐘基因啟動子甲基化在中樞和外周組織中的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

Wizard DNA purification resin：PROMEGA公司。CpG甲基化酶SssI：NEW ENGLAND BIOLAB公司。HS Taq：TAKARA公司。引物合成：上海生工生物有限公司。

1.2 動物

雄性C57BL/6J小鼠，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，SPF級，許可證號SCXK(軍)2007-004。3月齡小鼠10只飼養(yǎng)17個月至20月齡，作為老年組。老年組飼養(yǎng)至19月齡時，另購入3月齡小鼠9只飼養(yǎng)1個月至4月齡作為青年組。明暗時間為12 h∶12 h，室溫恒溫23℃，任意攝取水食。

1.3 取材

所有小鼠至預(yù)定月齡后，于同一時間點全部處死。取小鼠新鮮組織胃、血管、脾、腎及紋狀體，凍存于-80℃待用。

1.4 甲基化特異性聚合酶鏈式反應(yīng)

按TIANamp Genomic DNA Kit說明書提取小鼠基因組DNA。使用偏重亞硫酸鈉和對苯二酚對基因組DNA進行處理，使未發(fā)生甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶則未發(fā)生轉(zhuǎn)化。采用在線軟件(www.mspprimer.org/cgi-mspprimer/design.cgi)分析時鐘基因Per1/2、Cry1/2、Clock、Npas2、Bmal1/2的啟動子序列，并用該軟件設(shè)計每個時鐘基因的甲基化引物和非甲基化引物各一套[11]。DNA啟動子區(qū)域出現(xiàn)部分甲基化以“PM”表示，未出現(xiàn)甲基化以“U”表示。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0軟件。采用Fisher確切概率法對各組不同部位8種時鐘基因的甲基化頻率分別進行比較。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 紋狀體

青年組Cry1、Cry2啟動子甲基化，老年組Cry1啟動子甲基化。老年組Cry1和Cry2甲基化率與青年組相比無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 脾

青年組各時鐘基因啟動子均無甲基化，老年組Cry1、Bmal2和Npas2啟動子區(qū)甲基化率比青年組升高(P＜0.05)。見表2。

表1 兩組小鼠紋狀體時鐘基因啟動子區(qū)甲基化水平(n)

表2 兩組小鼠脾組織時鐘基因啟動子區(qū)甲基化水平(n)

2.3 胃

青年組和老年組Per1、Cry1和Bmal1啟動子均有甲基化。老年組Per1啟動子甲基化率降低(P＜0.05)，而Cry1和Bmal1啟動子甲基化率與青年組相比無顯著

性差異(P＞0.05)。見表3。

2.4 血管

青年組Bmal1、Bmal2啟動子甲基化，老年組Cry1、Cry2、Bmal1啟動子甲基化，老年組Bmal1甲基化率比青年組升高(P＜0.05)。見表4。

表3 兩組小鼠胃組織時鐘基因啟動子區(qū)甲基化水平(n)

表4 兩組小鼠血管組織時鐘基因啟動子區(qū)甲基化水平(n)

2.5 腎

青年組Cry1和Bmal2啟動子甲基化，老年組Cry1啟動子甲基化，兩組各基因啟動子甲基化率均無顯著性差異(P＞0.05)。見表5。

表5 兩組小鼠腎組織時鐘基因啟動子區(qū)甲基化水平(n)

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，衰老個體及衰老相關(guān)疾病患者體內(nèi)出現(xiàn)晝夜節(jié)律的異常[12]。晝夜節(jié)律由多種時鐘基因調(diào)控[4]，其DNA啟動子CpG島區(qū)域甲基化是基因轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳主要調(diào)控方法之一[13]。檢測時鐘基因的RNA水平是研究基因表達水平較直接的手段，但由于RNA檢測對于樣本提取的要求較高，導(dǎo)致該法的應(yīng)用較為局限。已有文獻證實，DNA甲基化水平增高能夠抑制基因表達[7]，因此，本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈式反應(yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)檢測DNA甲基化水平，間接反映基因表達的變化。該法對樣本要求較低，操作快速簡單，具有更高的使用價值。由于MSP為定性檢測，我們通過比較樣本中甲基化的發(fā)生頻率，檢測DNA啟動子CpG島區(qū)域甲基化水平差異。

Cry基因是生物鐘基因負反饋環(huán)的主要成員[14]。Cry基因所表達的隱花色素(Cryptochrome)是一種感光受體，能夠調(diào)節(jié)植物的生長和發(fā)育，以及動植物的生物節(jié)律[15]。以往研究發(fā)現(xiàn)，衰老果蠅Cry基因mRNA和蛋白表達均顯著減少[16]。Cry1和Cry2缺陷小鼠作為衰老模型，與野生型小鼠相比不僅認知功能降低，而且睡眠周期紊亂[17]。本研究顯示，Cry1啟動子甲基化在老年組中樞神經(jīng)組織和外周組織中均出現(xiàn)，尤其在衰老小鼠脾中，Cry1啟動子甲基化頻率比青年組增

高。已有證據(jù)顯示，DNA的甲基化能夠?qū)е虏豢赡娴膯幼映聊?，從而下調(diào)基因表達[7]。有研究證實，Cry1和Cry2的減少能夠?qū)е缕⒓毎心[瘤壞死因子-α和活化的CD3+/CD69+T細胞增多[18]。脾組織Cry1啟動子甲基化增高，下調(diào)Cry1表達，可能加速免疫系統(tǒng)的衰老進程。

Bmal1在時鐘基因轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路中起正向調(diào)節(jié)作用，它與視交叉上核以及外周時鐘細胞的生物節(jié)律高度相關(guān)[19]。已有研究指出，Bmal1功能障礙會導(dǎo)致生物鐘紊亂，且Bmal1缺失(Bmal1-/-)小鼠壽命減少，過早表現(xiàn)出衰老相關(guān)的表型[20-21]。研究證實，Bmal1基因缺失能在衰老過程中輕度影響血管促凝和抗凝途徑，隨著衰老進程，內(nèi)皮功能障礙增加，血栓形成風險增加[22]。Bmal1啟動子甲基化在血管組織中增加，下調(diào)Bmal1基因表達，可能引起衰老相關(guān)血管疾病。

作為Bmal1的旁系同源物，Bmal2同樣被證實與衰老相關(guān)。近期一項研究顯示，Bmal2的基因多態(tài)性與中國人對阿爾茨海默病的易感性相關(guān)[23]。Bmal2在帕金森病患者特定時間的白細胞中表達水平降低，提示Bmal2與衰老或疾病引起的免疫細胞功能異常相關(guān)[24]。本研究顯示，Bmal2啟動子甲基化頻率在老年小鼠脾組織中明顯升高，導(dǎo)致Bmal2在脾組織中表達降低，可能加速脾組織衰老進程。有待進一步探究。

Npas2最初在哺乳動物前腦中發(fā)現(xiàn)，但已被證明在外周組織中同樣表達[25]。它作為生物節(jié)律轉(zhuǎn)錄因子，與Bmal1形成二聚體，激活其他核心時鐘基因[26]。研究證實，Npas2與衰老存在聯(lián)系，Npas2與Clock基因共同減少能夠?qū)е滤ダ舷嚓P(guān)的神經(jīng)退行性病變[27]。有研究指出，風濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)Npas2的表達延遲，影響白細胞介素的節(jié)律性生產(chǎn)，在諸多時鐘基因中，它是與人體免疫炎癥狀態(tài)最相關(guān)的基因之一[28]。Npas2在衰老脾組織中甲基化頻率增加，下調(diào)脾中Npas2的表達，可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)老化，從而引起免疫相關(guān)疾病。

Per1是時鐘基因負反饋調(diào)控的主要轉(zhuǎn)錄因子之一，它與Cry基因相互作用后抑制Clock/Bmal1二聚體的轉(zhuǎn)錄活性[29]。Per1基因不僅是主要的時鐘基因，其表達存在節(jié)律性并且與衰老高度相關(guān)[30-31]。目前針對Per1作用于衰老的研究較少。本研究顯示，衰老小鼠胃組織中Per1基因啟動子甲基化頻率低于青年組，表明衰老小鼠胃組織Per1表達增加，可能引起衰老所致的胃功能減退。

我們的研究顯示，衰老小鼠脾、胃和血管組織中均出現(xiàn)時鐘基因啟動子甲基化頻率的改變，特別是在衰老小鼠脾組織中，Cry1、Bmal2、Npas2的甲基化頻率均顯著減少，提示時鐘基因甲基化改變可能與免疫系統(tǒng)的老化相關(guān)性較高。此外，衰老小鼠胃組織Per1啟動子甲基化頻率降低，血管組織Bmal1啟動子甲基化頻率升高，而中樞神經(jīng)組織紋狀體中并未出現(xiàn)甲基化頻率的改變?；谝陨辖Y(jié)果，我們的研究提示，時鐘基因啟動子在衰老小鼠不同組織中甲基化頻率的改變存在差異，時鐘基因啟動子甲基化的增齡性改變具有組織特異性。

紋狀體作為中樞神經(jīng)組織，其時鐘基因甲基化水平與外周的脾、胃和血管組織存在明顯差異。衰老小鼠模型中樞組織時鐘基因啟動子甲基化發(fā)生率較低，而外周組織時鐘基因甲基化發(fā)生率較高。雖然有研究發(fā)現(xiàn)，衰老小鼠、大鼠以及阿爾茨海默病患者腦組織整體基因組DNA甲基化水平有所降低[32]，但目前尚無針對衰老個體中樞組織時鐘基因啟動子CpG島甲基化的研究報道。我們認為，衰老小鼠中樞組織時鐘基因啟動子CpG島甲基化可能不是導(dǎo)致其晝夜節(jié)律改變的主要因素。

綜上所述，衰老小鼠時鐘基因Cry1、Per1、Bmal1、Bmal2、Npas2啟動子CpG區(qū)域甲基化頻率與青年小鼠相比有顯著性差異，這種差異存在明顯的組織特異性，提示時鐘基因啟動子甲基化對生物鐘的調(diào)節(jié)在衰老小鼠不同組織中的作用可能不同。時鐘基因Cry1、Per1、Bmal1/2、Npas2啟動子區(qū)域甲基化與衰老相關(guān)，可能作為抗衰老藥物研究的新靶點。

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Tissue-specific Changes of Clock DNAPromoter Methylation withAging

ZHU Yan-qiu1a,LU Lu1a,LI Lin1a,CAI Yan-ning1b,ZHANG Lan1a
1.a.Department of Pharmacology,b.Department of Neurobiology,Xuanwu Hospital,Capital Medical University, Beijing 100053,China

Objective To investigate the role of the clock gene promoter methylation in aging.Methods C57BL mice of 4-(young,n=9) and 20-(old,n=10)month-old were determined the promoter methylation level of clock genes(Per1/2,Bmal1/2,Cry1/2,Clock,Npas2)in the stomach,spleen,vascular,kidney and striatum with methylation-specific polymerase chain reaction(MSP).Results The incidence of promoter methylation of Cry1,Bmal2 and Npas2 in spleen increased in old mice(P＜0.05),while the promoter methylation of Per1 in stomach decreased(P＜0.05),and the promoter methylation of Bmal1 in vascular increased(P＜0.05).Conclusion Promoter methylation of some clock genes is involved in process of aging in a tissue-specific way.

aging;circadian rhythm;clock genes;promoter methylation

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.05.005

R339.3

A

1006-9771(2015)05-0514-05

2015-02-27

2015-04-07)

1.國家自然科學(xué)基金項目(No.81473373)；2.北京市自然科學(xué)基金項目(No.7132110)；3.北京市中醫(yī)管理局重點項目(No. KJTS2011-04)；4.北京市新世紀百千萬人才工程項目(No.008-0014)；5.首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項項目(No.首發(fā)2011-1001-05)；6.北京市教委新醫(yī)藥學(xué)科群項目(No.XK100270569)。

1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，a.藥物研究室；b.神經(jīng)生物室，北京市100053。作者簡介：祝艷秋(1990-)，女，漢族，江蘇泰州市人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，抗衰老藥理學(xué)。通訊作者：張?zhí)m(1972-)，女，北京市人，博士，教授，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)、中藥藥理學(xué)、抗衰老藥理學(xué)。E-mail:lanizhg@hotmail.com。