LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中雙氯芬酸濃度的不確定度評(píng)定

過(guò) 林，裘福榮，王猛猛，賀 敏，蔣 健

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院臨床藥理科，上海 201203)

雙氯芬酸鈉是芳基乙酸類非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥，其作用機(jī)制為抑制環(huán)氧化酶活性，從而阻斷花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，具有較強(qiáng)的抗風(fēng)濕、消炎、鎮(zhèn)痛和退熱作用，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。其特點(diǎn)是劑量小，起效快，不良反應(yīng)少，且耐受性好，長(zhǎng)期應(yīng)用無(wú)蓄積作用。

文獻(xiàn)中現(xiàn)有一些關(guān)于雙氯芬酸體內(nèi)的分析檢測(cè)方法報(bào)道［1－5］，判定測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確與否，主要是通過(guò)測(cè)量誤差來(lái)表示。近些年，國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局和中國(guó)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)相繼制定了《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》等技術(shù)規(guī)范，說(shuō)明不確定度作為測(cè)量的重要評(píng)定方法，已經(jīng)越來(lái)越受到重視。目前不確定度評(píng)價(jià)研究也越來(lái)越多［6－11］，它能夠更客觀、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)測(cè)定結(jié)果的質(zhì)量。新藥臨床藥動(dòng)學(xué)和生物等效性研究需進(jìn)行大量的生物樣品檢測(cè)工作，當(dāng)使用這些分析結(jié)果作為決策依據(jù)時(shí)，結(jié)果的可靠性直接決定了新藥的安全性及有效性，而該方面進(jìn)行不確定度評(píng)價(jià)的研究相對(duì)較少［8－11］，究其原因，主要是生物樣本基質(zhì)復(fù)雜，處理步驟繁多，結(jié)果變異的相關(guān)因素多，因此其不確定度評(píng)定較為困難。本文建立了液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測(cè)定人血漿中雙氯芬酸鈉濃度的方法，并對(duì)測(cè)定的不確定度進(jìn)行了評(píng)定，為藥動(dòng)學(xué)研究中進(jìn)行測(cè)量不確定度的評(píng)定提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

4000 Q－trap型LC-MS/MS(美國(guó)Applied Biosystems公司)，AB135－S型十萬(wàn)分之一分析天平(瑞士梅特勒公司);Allegra型高速離心機(jī)(Beckman公司)，VX2E型振蕩器(德國(guó)IKA公司)。雙氯芬酸鈉(批號(hào)100334－200302，純度100%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，內(nèi)標(biāo)4－羥基甲苯磺丁脲(批號(hào)0001407794，純度100%，美國(guó)Sigma公司)，乙腈(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)，甲酸、醋酸銨(分析純，中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，超純水為Milli－Q型純水系統(tǒng)制備，健康人空白血漿(上海曙光醫(yī)院I期病房提供)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分析條件 色譜條件:色譜柱選用Agilent C18(150 mm ×4.6 mm 5 μm)，流動(dòng)相由乙腈—水(含4 mmol乙酸銨，0.08% 甲酸)(75∶25，V/V)，流速為0.8 mL·min－1，柱溫 20℃，進(jìn)樣體積為 5 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)，氣簾氣(CUR)壓力為20 psi，噴霧氣(GS1)壓力為55 psi，干燥氣(GS2)壓力為55 psi，源噴射電壓(IS)為－4 000 V，離子源溫度(TEM)為400℃。雙氯芬酸及內(nèi)標(biāo)的掃描離子反應(yīng)(MRM)分別為 293.6→249.9、284.9→185.9，碰撞能量(CE)分別為 －14.8、－23.8 V。

2.2 對(duì)照品工作液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精確稱取雙氯芬酸鈉對(duì)照品11.07 mg(相當(dāng)于雙氯芬酸10.27 mg)，置于10 mL容量瓶中，加入乙腈定容，即得濃度為1.027 g·L－1雙氯芬酸儲(chǔ)備液。接著，用移液器(量程50 ～200 μL、200 ～1 000 μL)吸取乙腈稀釋儲(chǔ)備液，配制雙氯芬酸系列工作液(L1～L8)，過(guò)程見(jiàn)表1。

表1 雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

精確稱取4－羥基甲苯磺丁脲對(duì)照品2.10 mg，置于10 mL容量瓶中，加入乙腈定容，即得濃度為0.210 g·L－1的4－羥基甲苯磺丁脲儲(chǔ)備液。再以乙腈稀釋成濃度為4.2 μg·L－1的內(nèi)標(biāo)乙腈溶液。

2.3 含藥標(biāo)準(zhǔn)血漿的配制 用移液器(量程2～20 μL)分別吸取5 μL系列濃度的雙氯芬酸工作液(L2～L8)于1.5 mL EP離心管中，然后用移液器(量程 50 ～200 μL)分別加入人空白血漿 95 μL，渦旋30 s混勻，配制成雙氯芬酸濃度分別為1.0、5.0、20.0、50.0、200、500 和 2 000 μg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本。

按上述方法配制2.0、50.0 和1 600 μg·L－1的含藥標(biāo)準(zhǔn)血漿，分別作為低、中、高(L、M、H)濃度質(zhì)控樣品，進(jìn)行方法的精密度和回收率考察。

2.4 血漿樣品處理方法 采用蛋白沉淀法處理血漿樣品。用移液器(量程50～200 μL)吸取100 μL血漿樣品，加入 300 μL(量程 200 ～1 000 μL)內(nèi)標(biāo)乙腈溶液，渦旋振蕩3 min，經(jīng)16 000 rpm離心5 min后，取上清液16 000 rpm再次離心5 min，吸取上清液進(jìn)樣。

2.5 數(shù)學(xué)模型及不確定度的來(lái)源分析 標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=bC+a其中:C為雙氯芬酸的濃度(μg·L－1);b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距;y=As/Ai;As為雙氯芬酸峰面積響應(yīng)值;Ai為內(nèi)標(biāo)峰面積響應(yīng)值。所以，數(shù)學(xué)模型為C=(y－a)/b+d1+d2+…公式中，d1、d2為對(duì)不確定度有貢獻(xiàn)的影響因素，主要為:(1)雙氯芬酸樣品檢測(cè)精密度;(2)雙氯芬酸儲(chǔ)備液和系列工作液的配制:包括天平稱量、容量瓶允差和移液器允差等;(3)血漿樣品的配制和提取;(4)回收率;(5)LC-MS/MS儀器測(cè)定;(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合;(7)溫度等。這些步驟中的每個(gè)因素都會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響，因此都是引入的不確定度的來(lái)源。

3 結(jié)果

不確定度分量可分為A類和B類。A類不確定度是由統(tǒng)計(jì)確定的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量，B類不確定度是用非統(tǒng)計(jì)方法確定的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量。

3.1 A類不確定度評(píng)定 由重復(fù)測(cè)量(精密度)引入的不確定度ur(1)。配制低、中、高三濃度質(zhì)量樣品，每批每一濃度配制5份(n=5)，共做3批，分別在3 d內(nèi)進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定，代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的濃度，結(jié)果見(jiàn)表2。

計(jì)算合并樣本偏差:

式中k為每組平行測(cè)定份數(shù)(n=5)，j為組數(shù)(m=3)，G 為組別(L，M，H)。經(jīng)計(jì)算，Sp(C，L)=0.182 μg·L－1，Sp(C，M)=2.47 μg·L－1，Sp(C，H)=70.8 μg·L－1。以平均值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差的公式為經(jīng)計(jì)算0.0471 μg·L－1637 μg·L－1，Sp18.3 μg·L－1。

表2 雙氯芬酸重復(fù)測(cè)定濃度數(shù)據(jù)

測(cè)量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur1，()G=經(jīng)計(jì)算，u(1，L)=0.0239，u(1，M)rr=0.0136，ur(1，H)=0.0122。

3.2 B類不確定度評(píng)定

3.2.1 稱量引入的不確定度，ur(2) 用十萬(wàn)分之一的電子天平分別稱取雙氯芬酸鈉和內(nèi)標(biāo)。稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(2)u(Δ)為天平非線性誤差引起的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度，u(Δ0)為天平調(diào)零引起的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度。依據(jù)計(jì)量檢定證書(shū)，本實(shí)驗(yàn)所用電子天平的天平分度為e=0.01 mg。按均勻考慮，天平的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度為:u(Δ)==0.002 9 mg。

天平自動(dòng)調(diào)零作為一次扣皮，其a0=a，則天平自動(dòng)調(diào)零引起的誤差為:u(Δ0)=0.0029 mg。不考慮重復(fù)性誤差時(shí)，稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:u(2)mg。因此，稱量雙氯芬酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur(2)=

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度，ur(3) 配制儲(chǔ)備液所用容量瓶為10 mL容量瓶，其最大允許誤差為±0.020 mL。實(shí)驗(yàn)室由空調(diào)控制，保持恒溫恒濕，且供試品溶液和對(duì)照品溶液配制時(shí)環(huán)境條件相同，容量瓶等精密玻璃量器和溶劑的膨脹系數(shù)都相同，故可忽略由溫度引起的相對(duì)不確定度。按均勻分布，容量瓶相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:ur(x，p)=15，p為量程。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制用到的移液器均為Glison移液器，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)用到量程有:p1:200～1 000 μL，p2:50 ～200 μL，p3:2 ～20 μL;按廠商提供的技術(shù)參數(shù)，各移液器的允許誤差分別為 ±8 μL，±1.6 μL ，±0.20 μL;由于溫度對(duì)于移液管影響較小，忽略不計(jì)。按均勻分布，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中用到1次10 mL容量瓶、2次量程50 ～200 μL 的移液器(其中97 μL 1 次、200 μL 1次)、14次量程200～1000 μL的移液器(其中903 μL 1 次、800 μL 1 次、750 μL 3 次，600 μL 3次、400 μL3 次、250 μL3 次)，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

3.2.3 配制含藥血漿時(shí)引入的不確定度，ur(4)在EP管中加入人空白血漿95 μL和5 μL系列濃度的雙氯芬酸工作液，混勻，不確定度主要由移液器引起。配制血漿標(biāo)準(zhǔn)液所用移液器量程有:50～200 μL，2 ～ 20 μL。由于溫度對(duì)定容的影響非常小，忽略不計(jì)。因此，配制血漿溶液時(shí)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

3.2.4 血漿樣品蛋白沉淀過(guò)程引入的不確定度，ur(5) 配制低、中和高濃度質(zhì)控樣品各5份，蛋白沉淀處理后進(jìn)樣，得到峰面積為B;按照相同方法配制低、中和高濃度的乙腈溶液樣品各3份，進(jìn)樣后得到的峰面積為A，雙氯芬酸的回收率=B/A ×100%。結(jié)果，低、中和高濃度質(zhì)控樣品平均回收率分別為(94.90 ± 6.34)%，(100.74 ± 6.01)%，(94.99±3.46)%?；厥章实南鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:u其中為回收率各組別的偏差為回收率各組別的均值。因此，

3.2.5 儀器量化引入的不確定度ur(6) 所用AB 4000 Q－trap型號(hào)的儀器，其定量的最大允差為3%，按均勻分布，其相對(duì)不確定度為:

3.2.6 線性回歸過(guò)程引入的不確定度ur(7) 生物樣本中藥物測(cè)定時(shí)需要先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到未知樣品的濃度，直線回歸是最常用且最簡(jiǎn)單的一種，回歸方程的建立對(duì)計(jì)算未知樣品的濃度至關(guān)重要。制標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本，以y=As/Ai計(jì)算不同濃度的y值(見(jiàn)表3)，共擬和3條標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，其平均斜率a=0.0434，截距b=0.0173。

表3 雙氯芬酸與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(n=3)

剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差為:

自相關(guān)方差:

公式中P測(cè)定質(zhì)控樣本的總次數(shù)(P=15);N測(cè)定標(biāo)曲樣本的總次數(shù)(N=i×j=7×3=21);i為標(biāo)曲血漿樣本的序數(shù)(i=7);j為標(biāo)曲每個(gè)濃度血漿樣本測(cè)定次數(shù)(j=3);每組標(biāo)曲血漿樣本濃度的平均值;Ci第i個(gè)標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液的濃度;G為組別(L、M、H)。

其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:ur(7，G)=ur(C，G)

3.3 合成不確定度的評(píng)定 雙氯芬酸濃度測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

因此，uc，r，L=0.376，uc，r，M=0.039 7，uc，r，H=0.029 2。

低、中和高濃度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:

3.4 擴(kuò)展不確定度的評(píng)定 由于生物樣品檢測(cè)過(guò)程比較復(fù)雜，涉及不確定度分量較多，因此可估計(jì)為正態(tài)分布，包含因子取k=2，此時(shí)對(duì)應(yīng)的置信概率為95%，雙氯芬酸的濃度測(cè)定的擴(kuò)展不確定度為:

人血漿中低、中和高濃度質(zhì)控樣品中雙氯芬酸的濃度可分別表示為(1.97 ± 1.482)、(46.97 ±3.72)、(1494 ± 87.2)μg·L－1，k=2(95% 的置信區(qū)間)。

4 討論

隨著國(guó)內(nèi)外分析檢測(cè)手段的豐富，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)在不斷提高，對(duì)分析結(jié)果的評(píng)定也越來(lái)越標(biāo)準(zhǔn)化、科學(xué)化，不確定度評(píng)定檢測(cè)方法也越來(lái)越重要。中國(guó)合格評(píng)定認(rèn)可委員會(huì)對(duì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行認(rèn)可時(shí)，也要求開(kāi)展測(cè)量不確定度的評(píng)定。由于生物樣本基質(zhì)復(fù)雜，樣本濃度很低，檢測(cè)過(guò)程繁瑣，目前有關(guān)測(cè)定生物樣本中藥物濃度不確定度評(píng)定的文獻(xiàn)相當(dāng)有限，不確定度評(píng)定也并未如方法學(xué)驗(yàn)證那樣具有公認(rèn)和指導(dǎo)性的方法。本文以人血漿中雙氯芬酸濃度測(cè)定為模板，建立相關(guān)不確定度分析方法。

本文按照實(shí)驗(yàn)的順序逐步尋找人血漿中雙氯芬酸濃度測(cè)定過(guò)程的不確定度的來(lái)源，重點(diǎn)考查了測(cè)量重復(fù)性(精密度)、稱量對(duì)照品、配制標(biāo)準(zhǔn)溶液、配制標(biāo)準(zhǔn)血漿、回收率、儀器量化、線性回歸等因素。在本方法不確定度評(píng)定中，由擴(kuò)展不確定度可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合過(guò)程對(duì)不確定影響的貢獻(xiàn)最大，其次是回收率，尤其是對(duì)低濃度而言。究其原因，主要是由于在藥代動(dòng)力學(xué)研究中，生物樣本待測(cè)物含量極低，標(biāo)曲的最低濃度非常小，在本實(shí)驗(yàn)中最低濃度僅1 μg·L－1，因此相對(duì)誤差被放大，操作過(guò)程中的任何微小誤差都會(huì)造成很大的影響，并且標(biāo)曲最低點(diǎn)溶液的配制經(jīng)過(guò)多步稀釋，誤差經(jīng)多次累積。在藥代動(dòng)力學(xué)研究中進(jìn)行標(biāo)曲擬合時(shí)，通常都使用了加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，注重了低濃度點(diǎn)的擬合的準(zhǔn)確性，但曲線中高濃度點(diǎn)在剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)定時(shí)，對(duì)低濃度點(diǎn)的不確定度影響會(huì)很大。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)方法學(xué)考察的標(biāo)曲是3個(gè)分析批的標(biāo)曲，分3 d配制并測(cè)定，而部分文獻(xiàn)［8－10］采用的方法是同一標(biāo)曲連續(xù)進(jìn)樣3次來(lái)考察。因此，標(biāo)準(zhǔn)血漿配制、固相萃取、儀器響應(yīng)波動(dòng)等因素均會(huì)疊加影響不確定度，造成標(biāo)曲擬合對(duì)不確定度的影響最大。

通過(guò)對(duì)LC-MS/MS法測(cè)定血漿中雙氯芬酸濃度的測(cè)量不確定度評(píng)定，為合理改進(jìn)分析方法，將檢測(cè)誤差降至最小提供了可靠依據(jù)。對(duì)于影響較大的因素，在測(cè)量過(guò)程中應(yīng)加以關(guān)注，并且將這些不確定度分量較大的步驟細(xì)化，找出影響因素，提供解決辦法。在日常工作中，對(duì)一些步驟可加以關(guān)注。例如配制溶液盡可能使用同一規(guī)格的量器、選用精密的量器和儀器、血漿前處理方法盡可能簡(jiǎn)單重現(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合尤其要注意低濃度的樣品等等。通過(guò)減小測(cè)量結(jié)果的不確定度，使測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，為建立檢測(cè)方法提供科學(xué)指導(dǎo)。在臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究中，如何結(jié)合自身特點(diǎn)，建立的評(píng)定方法如何全面準(zhǔn)確的反映分析過(guò)程中的影響因素，客觀評(píng)價(jià)不確定度的結(jié)果，建立公認(rèn)和指導(dǎo)性的方法以及評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，都需要作進(jìn)一步的探索。

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