左西孟旦對犬體外循環(huán)術(shù)后肺保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究

王紀(jì)源，葛圣林，馮俊波

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟外科，安徽合肥 230022)

體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)技術(shù)的誕生和發(fā)展使得許多心臟手術(shù)得以開展，但體外循環(huán)術(shù)中肺組織由于全身炎癥反應(yīng)及缺血再灌注而受到損傷，導(dǎo)致肺功能下降，甚至導(dǎo)致急性呼吸窘迫癥，嚴(yán)重影響了患者的臨床轉(zhuǎn)歸，且死亡率較高［1］。最新研究發(fā)現(xiàn)左西孟旦(LS)作為新一代鈣增敏劑具有臟器保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)通過建立實(shí)驗(yàn)用雜種犬體外循環(huán)模型，對左西孟旦對體外循環(huán)術(shù)后的肺保護(hù)作用進(jìn)行初步研究探討。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康雜種犬32只，雌雄不拘，體質(zhì)量(12±1.94)kg，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

主要試劑及儀器:LS(山東齊魯制藥公司，批號:411006f3);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司);-80℃低溫冰箱(日本三洋公司);光學(xué)顯微鏡(CX 40型，日產(chǎn)Olympus);Sarns5000型人工心肺機(jī)(美國);電子顯微鏡(日產(chǎn)日立公司);BS 110S型電子天平(德國Sartorius公司);JHF1-DHG-9076A型恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中西泰安技術(shù)服務(wù)有限公司);WI313182型血?dú)夥治鰞x(東西儀北京科技有限公司);CPB配套管，CPB插管，氣管插管等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型復(fù)制 實(shí)驗(yàn)犬術(shù)前禁食8～12 h，靜脈注射戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)，待麻醉完全起效后，對犬進(jìn)行氣管內(nèi)插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，設(shè)置呼吸機(jī)潮氣量、氧濃度、呼吸頻率分別為12 mL·kg-1、45%、每分鐘25次。輔助呼吸后，股動(dòng)脈穿刺并置測壓管連接監(jiān)護(hù)儀，觀察犬的生命體征狀況;胸骨正中切口，充分止血后切開心包，暴露心臟，在主動(dòng)脈根部及右心耳處分別插管，建立CPB。開始CPB后，逐步進(jìn)行降溫至30℃時(shí)阻斷鉗阻斷升主動(dòng)脈，主動(dòng)脈根部插入灌注針，通過灌注針灌注心臟停搏液使心臟完全停搏后置冰泥保護(hù)心肌，同時(shí)停止機(jī)械通氣，每半小時(shí)灌注一次，主動(dòng)脈阻斷持續(xù)1 h，再行升主動(dòng)脈開放2 h，主動(dòng)脈開放后立即恢復(fù)機(jī)械通氣，CPB輔助，待血流動(dòng)力學(xué)完全恢復(fù)穩(wěn)定后再逐漸停止CPB。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物雜種犬32只隨機(jī)分為四組:(1)C組:開胸后常規(guī)建立體外循環(huán)，體外循環(huán)過程中不做特殊處理;(2)P組:于主動(dòng)脈阻斷后經(jīng)肺動(dòng)脈灌注低溫氧和血(氧和血引自氧和器，經(jīng)冰水槽浴，保持氧和血溫度在0～4℃左右)，肺動(dòng)脈灌注流量40～50 mL·kg-1·min-1)，灌注壓30 mmHg左右，灌注液量30～45 mL·kg-1，灌注時(shí)間控制在8～10 min;(3)LSIV組:于犬麻醉后靜脈注射LS(65 g·kg-1)，至主動(dòng)脈阻斷前注射完畢;(4)LSP組:主動(dòng)脈阻斷后經(jīng)肺動(dòng)脈灌注含LS(65 g·kg-1)的低溫氧和冷血，具體灌注方法同P組。

1.2.3 標(biāo)本的采集和處理 待實(shí)驗(yàn)完成后，高鉀注射處死實(shí)驗(yàn)犬，取出右肺組織，用4℃鹽水沖洗肺組織并用濾紙吸干表面水分。取中段肺組織約0.3 g放入10%福爾馬林溶液固定24 h后，取出肺組織，石蠟包埋、切片、蘇木精—伊紅(HE)染色，在光鏡下的觀察肺組織的形態(tài)并拍攝照片;取下段0.8 mm ×0.8 mm ×0.8 mm 大小的肺組織置于 2.5%戊二醛溶液中固定，完成后對肺組織進(jìn)行切片通過電鏡觀察肺組組形態(tài)并拍攝照片。剩余肺組織于凍存管中放置后在放入-80℃冰箱凍存，留作標(biāo)本測定。

1.2.4 肺組織MDA含量及SOD活性測定 取凍存的肺組織按試劑盒要求制備組織勻漿液，應(yīng)用硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)法測定肺組織中MDA的含量及應(yīng)用化學(xué)比色法測定肺組織中超氧化物歧化酶(SOD)的活性(測定過程嚴(yán)格按照試劑盒說明操作)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，各組計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為組間顯著性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織中MDA含量及SOD活性 與C組相比，LSP組、P組及LSIV組MDA含量均明顯降低，且SOD活性明顯升高(P＜0.01)，與LSP組相比，LSIV組及P組MDA含量明顯升高，且SOD活性明顯降低(P＜0.01)，P組和LSIV組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見表1。

表1 各組MDA含量及SOD活性(±s)(n=8)

表1 各組MDA含量及SOD活性(±s)(n=8)

注:多重比較:與C組相比，＊＊P＜0.01，與LSP組相比，##P＜0.01。

組別 MDA含量(nmol/mgprot) SOD活性(U/mgprot)C組64.22 ±7.35 108.38 ±12.27 P 組 22.06 ±3.85＊＊## 197.74 ±16.33＊＊##LSIV 組 20.33 ±3.04＊＊## 207.18 ±18.65＊＊##LSP 組 6.54 ±1.08＊＊ 307.53 ±23.10＊＊F 219.460 142.973 P ＜0.01 ＜0.01

2.2 肺組織光學(xué)顯微鏡形態(tài)變化 光鏡下可見C組細(xì)胞間質(zhì)水腫，炎細(xì)胞浸潤，有大量的紅細(xì)胞，炎性細(xì)胞、漿液性滲出液在肺泡腔內(nèi)。肺泡結(jié)構(gòu)基本被破壞，有一部分塌陷，還有部分完全消失，在消失的肺泡內(nèi)，可發(fā)現(xiàn)代償性肺氣腫。P組和LSIV組肺組織也有肺泡間質(zhì)水腫，但較C組均明顯減輕，肺泡內(nèi)炎細(xì)胞浸潤及出血、滲出都有所減少，組織損傷程度明顯較輕，LSP組肺泡間隔水腫程度最輕，肺泡內(nèi)僅有少許滲出物，炎癥細(xì)胞浸潤程度較其余幾組也明顯減輕(圖1)。

2.3 肺組織電子顯微鏡形態(tài)變化 電鏡下C組Ⅱ型上皮細(xì)胞線粒體腫脹明顯，體積增大，線粒體基質(zhì)電子密度降低，脊紊亂消失，板層小體排空明顯，細(xì)胞膜上微絨毛減少，部分細(xì)胞核呈多形性。LSIV組和P組Ⅱ型上皮細(xì)胞線粒體輕度腫脹，嵴排列稍紊亂，板層小體空泡化稍減輕，胞膜上微絨毛稍減少，細(xì)胞核多呈橢圓形。LSP組Ⅱ型上皮細(xì)胞線粒體腫脹程度最輕，嵴排列紊亂程度也明顯減輕，較其余幾組，板層小體空泡化明顯減輕且包膜上微絨毛也明顯減少，大多細(xì)胞核為橢圓形(圖2)。

3 討論

隨著心臟外科技術(shù)的發(fā)展，體外循環(huán)心內(nèi)直視技術(shù)在很多醫(yī)院得到了開展，大量理論研究和臨床實(shí)踐已經(jīng)表明，急性肺損傷已經(jīng)成為體外循環(huán)手術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一，幾乎所有患者體外循環(huán)術(shù)后均有一定程度的肺損傷，輕者僅表現(xiàn)為一過性的臨床癥狀，重者表現(xiàn)為急性呼吸衰竭，危及生命。研究表明急性肺損傷主要與全身炎癥反應(yīng)、缺血再灌注損傷及體外循環(huán)過程中肺處于高氧耗高代謝狀態(tài)有關(guān)。全身炎癥反應(yīng)主要是麻醉、手術(shù)創(chuàng)傷、體外循環(huán)等因素對機(jī)體造成的打擊，尤其是體外循環(huán)開始時(shí)，血液等需與人工管道等非生理接觸導(dǎo)致補(bǔ)體系統(tǒng)的激活［2］，補(bǔ)體激活產(chǎn)物刺激中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集并進(jìn)入肺間質(zhì)和肺泡，從而導(dǎo)致肺水腫、肺順應(yīng)性降低，血氧含量下降［3］;其次是肺臟的缺血再灌注引起的損傷，體外循環(huán)過程中同時(shí)停止了機(jī)械通氣，肺處于缺血缺氧狀態(tài)，產(chǎn)生大量毒性氧代謝產(chǎn)物和氧自由基，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，產(chǎn)生多種醛類物質(zhì)、如丙二醛等，改變了生物大分子的功能、破壞了核酸及染色體從而引起肺損傷。另外，肺的缺血再灌注導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減少了內(nèi)皮源性舒血管物質(zhì)一氧化氮(NO)的合成而引起肺損傷。Palatianos等［4］研究表明，小劑量的NO可以預(yù)防中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)積聚。

LS是一種新型的鈣增敏劑，于2000年在瑞典上市，因其既能夠提高心肌收縮力，又不增加心肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度和細(xì)胞耗氧而被被臨床用于治療各種急性心力衰竭病。有研究指出，LS具有減少炎癥因子的產(chǎn)生、抗細(xì)胞凋亡、抗缺血再灌注等作用。Gecit等［5］對小鼠腎臟缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過LS腹腔注射的實(shí)驗(yàn)組與對照組對比，腎組織中保護(hù)性酶SOD含量明顯升高，而MDA含量明顯減少。Honich等［6］應(yīng)用阻斷/開放小鼠前降支的方法制作的小鼠心肌缺血再灌注的損傷模型中，再灌注前應(yīng)用LS能明顯減少心肌梗死面積。研究表明，左西孟旦明顯減少心肌細(xì)胞的凋亡，而且其可以上調(diào)心肌細(xì)胞中抗凋亡基因bcL-2的表達(dá)，減少可溶性凋亡信號因子Fas/Fas配體的產(chǎn)生，從而抗發(fā)揮其抗心肌細(xì)胞凋亡的作用［7-8］。Dubin 等［9］研究表明，應(yīng)用LS后，感染性休克腸道血流會(huì)增加，黏膜下酸中毒同樣可以被減輕，這可能是因?yàn)長S能夠改善腸道灌注。Scheiermann等［10］在感染性休克動(dòng)物模型中應(yīng)用了LS，研究發(fā)現(xiàn)炎癥的釋放被抑制，酸中毒被減輕，生存時(shí)間得到了延長;另外在大鼠的急性肺損傷模型中，與多巴酚丁胺(DOB)組及對照組相比，應(yīng)用LS后，肺組織炎癥反應(yīng)明顯可以被減輕，細(xì)胞凋亡也可以被抑制，LS的免疫調(diào)節(jié)以及抗凋亡的特性可能是其保護(hù)器官功能的又一重要機(jī)制［11］，在犬的CPB模型中，會(huì)有氧自由基過量增多，與肺組織中的細(xì)胞膜產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加導(dǎo)致Ca2+超載、線粒體腫脹，影響細(xì)胞膜內(nèi)的能量代謝，導(dǎo)致細(xì)胞損傷;脂質(zhì)過氧化反應(yīng)還會(huì)導(dǎo)致溶酶體膜損傷引起溶酶體外漏再次加重細(xì)胞損傷。OFR還可通過與蛋白質(zhì)中的殘基發(fā)生反應(yīng)使蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)被破壞，損傷蛋白質(zhì)功能、降低或喪失蛋白酶的活性，從而改變肺的結(jié)構(gòu)，引起肺組織損傷;這些都是OFR造成肺損傷的重要因素。氧自由基是肺組織的缺血再灌注所引起的肺損傷起著重要作用，貫穿整個(gè)損傷過程。其中膜結(jié)構(gòu)脂質(zhì)過氧化過程會(huì)形成一種毒性較大的過氧化產(chǎn)物MDA［12］，而SOD是一種重要的氧自由基清除劑他們接過僅比較穩(wěn)定，容易測定，是目前公認(rèn)的能較好反映機(jī)體內(nèi)氧自由基水平及脂質(zhì)過氧化程度的間接指標(biāo)［13］。本研究顯示，與C組相比，LSP組、P組及LSIV組MDA含量均明顯降低，且SOD活性明顯升高(P＜0.01)，與LSP組相比，LSIV組及P組MDA含量明顯升高，且SOD活性明顯降低(P＜0.01)，P組和LSIV組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果示單純肺動(dòng)脈灌注、LS靜脈注射及肺動(dòng)脈灌注均具有肺保護(hù)作用，但其具體機(jī)制待進(jìn)一步研究。

綜上所述，雖然目前CPB術(shù)后肺損傷的機(jī)制尚未完全明確，但應(yīng)是一個(gè)多因素的共同作用的結(jié)果，可能與CPB術(shù)后全身炎癥反應(yīng)、肺組織的缺血—再灌注損傷有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過建立犬體外循環(huán)肺模型，并使用靜脈注射、肺動(dòng)脈灌注使用LS等不同的實(shí)驗(yàn)方法，得出結(jié)論LS肺動(dòng)脈灌注可明顯減輕術(shù)后MDA含量及增加SOD活性，具有急性肺損傷的保護(hù)作用。

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