大孔型離子交換樹脂分離純化右旋糖酐酶

黎志德，常國(guó)煒，黃曾慰，曾練強(qiáng)，梁達(dá)奉

（廣州甘蔗糖業(yè)研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510316）

大孔型離子交換樹脂分離純化右旋糖酐酶

黎志德，常國(guó)煒，黃曾慰，曾練強(qiáng)，梁達(dá)奉*

（廣州甘蔗糖業(yè)研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510316）

本試驗(yàn)使用大孔型離子交換樹脂對(duì)來源于重組畢赤酵母的右旋糖酐酶進(jìn)行分離純化，結(jié)果表明：D151離子交換樹脂能有效地吸附右旋糖酐酶，靜態(tài)吸附4 h后，酶的吸附率達(dá)到53%，24 h后，吸附率達(dá)到95%；動(dòng)態(tài)洗脫實(shí)驗(yàn)離子交換樹脂可以分離酶蛋白和雜蛋白，酶的比活力提高2.43倍，但酶的回收率較低，只有8%。

右旋糖酐酶；大孔型；離子交換樹脂；右旋糖酐酶

0 前言

右旋糖酐酶(Dextranase)可以專一性水解α-1,6-糖苷鍵，將右旋糖酐水解成小分子的寡聚糖[1]。右旋糖酐酶適合在制糖生產(chǎn)中使用，加入0.05 U/mL的右旋糖酐酶即可將蔗汁中濃度為800～900 mg/(kg·°Bx)的右旋糖酐完全去除[2]。同時(shí)，右旋糖酐酶在甘蔗亞硫酸法制糖[3]和原糖精煉[4]的應(yīng)用性試驗(yàn)中均有良好的效果，可見該酶具有在工業(yè)上應(yīng)用的潛力。所以，尋找一種簡(jiǎn)單易行的方法對(duì)右旋糖酐酶進(jìn)行一定程度的純化，去除多余的菌體、營(yíng)養(yǎng)成分以及色素等雜質(zhì)，避免在長(zhǎng)時(shí)間常溫存放時(shí)性狀變壞[5]就顯得十分有意義。離子交換樹脂作為一種常用的分離材料，可用于分離短肽和蛋白質(zhì)等，例如溶菌酶[6]、乳糖酶[7]、乳鏈球菌肽[8]。其中，Cheigh[9]等使用離子交換樹脂實(shí)現(xiàn)一步純化Nisin短肽。加入異丙醇到流動(dòng)相對(duì)離子樹脂柱進(jìn)行線性梯度洗脫，可以迅速分離多種標(biāo)準(zhǔn)蛋白[10]。本文主要探討離子交換樹脂在純化右旋糖酐酶上應(yīng)用方式，并對(duì)純化效果以及效率進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

ZK11重組畢赤酵母發(fā)酵右旋糖酐酶酶液（廣州

甘蔗糖業(yè)研究所）；標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T-2000（美國(guó)法瑪西亞公司）；檸檬酸，3,5-二硝基水楊酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硫酸鎂，硫酸銨，磷酸氫二鈉，硫酸銨，95%酒精，無水亞硫酸鈉，酒石酸鉀鈉，氫氧化鈉，苯酚（均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；離子交換樹脂D301K、D380、D303、001X7、D151、D152（華東理工大學(xué)上海華震科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

AL104電子分析天平（美國(guó)Mettler公司）；Himac CR22GⅡ冷凍高速離心機(jī)（日本Hitachi公司）；Model7581型恒流泵（美國(guó)MasterFlex公司）；Vivaflow 200 PES 10000超濾膜（德國(guó)Sartorius公司）；SUKUN SKY-2102C搖床培養(yǎng)箱（寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠）；DK-S24型電熱恒溫水浴箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；2800型紫外-可見分光光度計(jì)（美國(guó)Unico公司）；BSZ-40自動(dòng)部分收集器，BT100-2數(shù)顯恒流泵（上海滬西分析儀器廠有限公司）；電爐、移液槍、槍頭、比色管等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 酶液的前處理

將硫酸銨晶體研磨至粉末狀，添加至酶液中溶解，4℃下靜置過夜；取出，以12000 r/min離心10 min，分別測(cè)定上清液和沉淀物的酶活和蛋白濃度，計(jì)算出酶提取率和蛋白的總回收；按照酶提取率和蛋白回收率，選擇沉淀效果最佳的硫酸銨飽和度。

將沉淀后的蛋白用pH 5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液溶解，再用孔徑為10 kDa的超濾膜進(jìn)行脫鹽濃縮，并除去大部分分子量小于10 kDa的雜蛋白以及其他小分子雜質(zhì)，置于4℃保存?zhèn)溆?。酶活測(cè)定方法按DNS法，蛋白濃度測(cè)定按考馬斯亮藍(lán)G-250法[11]。

酶活定義：每分鐘在標(biāo)準(zhǔn)右旋糖酐底物T-2000中釋放出1 μmol還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位，以U表示。

2.2 離子交換樹脂的預(yù)處理

離子交換樹脂先用飽和食鹽水充分浸泡，然后逐步降低浸泡液中的食鹽濃度直到零，酸型樹脂先用1 mol/L NaOH溶液浸泡，再用1 mol/L鹽酸浸泡，清洗至中性后常溫保存?zhèn)溆?；堿型樹脂先用1 mol/L鹽酸浸泡，再用1 mol/L NaOH溶液浸泡，同樣清洗至中性后常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 離子交換樹脂的初步篩選

取按2.1節(jié)處理后的右旋糖酐酶酶液，分別加入50 mg/mL的離子交換樹脂D301K、D380、D303、001X7、D151、D152，置于恒溫?fù)u床，16℃、100 r/min吸附12 h，去掉清液，用與酶液等體積，濃度為100 mg/mL的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫1 h，分別測(cè)定各樣本洗脫液的A280nm值，計(jì)算出洗脫液中右旋糖酐酶回收率和蛋白回收率，選出效果最優(yōu)的2種離子交換樹脂。其中280 nm為蛋白特征吸收波長(zhǎng)，A280nm值常被用于層析分離中流動(dòng)相蛋白含量的快速測(cè)定[12]。

2.4 樹脂用量對(duì)右旋糖酐酶靜態(tài)吸附效果的影響

取2.1節(jié)處理后的右旋糖酐酶酶液，加入100、200、300和400 mg/mL從2.3節(jié)中篩選出的樹脂，置于恒溫?fù)u床，16℃、100 r/min吸附1 h，去掉清液，加入等體積的10 mg/mL氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，分別測(cè)定加入樹脂后的pH，各樣本洗脫液的A280nm值，并計(jì)算出洗脫液中右旋糖酐酶回收率和蛋白回收率，選出最優(yōu)的樹脂及其用量。

2.5 吸附時(shí)間對(duì)右旋糖酐酶靜態(tài)吸附效果的影響

取按2.1節(jié)處理后的右旋糖酐酶酶液，選擇按2.4節(jié)中選出的最適用量加入離子交換樹脂，置于恒溫?fù)u床，16℃、100 r/min進(jìn)行吸附反應(yīng)，在1、2、4、8、24 h后各取1次清液，測(cè)定清液中剩余的酶活，計(jì)算出酶的吸附率，選出最佳靜態(tài)吸附時(shí)間。

2.6 鹽溶液種類對(duì)洗脫效率的影響

取按2.5節(jié)中吸附后的離子交換樹脂，用原酶液一半體積的100 mg/mL濃度的氯化鈉、硫酸鎂和硫酸銨溶液進(jìn)行洗脫，置于恒溫?fù)u床，16℃，100 r/min洗脫1 h，取出各樣本清液，測(cè)定清液中的酶活，計(jì)算出鹽溶液的洗脫率，選出最佳的鹽溶液。

2.7 洗脫鹽溶液濃度對(duì)洗脫效率的影響

取出按2.5節(jié)吸附后的離子交換樹脂，以原酶液體積的一半，加入100、200、300 mg/mL濃度的鹽溶液進(jìn)行洗脫，置于恒溫?fù)u床，16℃、100 r/min洗脫1 h，取出各樣本清液，測(cè)定清液中的酶活，計(jì)算出鹽溶液的洗脫率，選出最佳的鹽溶液濃度。

2.8 洗脫時(shí)間對(duì)洗脫效率的影響

2.9 離子交換樹脂動(dòng)態(tài)洗脫純化右旋糖酐酶

在長(zhǎng)1 m、內(nèi)徑2.4 cm的玻璃層析柱中，裝入經(jīng)過預(yù)處理的樹脂約150 mL，靜置一段時(shí)間后確定無氣泡和斷層后，放入略小于層析柱內(nèi)徑的濾紙片保護(hù)床面。當(dāng)樹脂床表面僅余1 mm液層時(shí)，吸取10 mL經(jīng)預(yù)處理樣品，小心注入層析柱樹脂床中央，待大部分樣品進(jìn)入樹脂床后，加入大約1 cm高的蒸餾水，打開層析柱下端閥門，再小心加入約5 cm高的100 mg/mL NaCl洗脫液，開啟恒流泵，流速為1 Bv/h，部分收集器收集時(shí)間為每管5 min，總收集時(shí)間為2 h。

3 結(jié)果與分析

3.1 硫酸銨沉淀右旋糖酐酶

按2.1用硫酸銨沉淀右旋糖酐酶，在不同飽和度下，右旋糖酐酶液酶提取率和蛋白提取率見圖1。

圖1 硫酸銨沉淀純化右旋糖酐酶

從圖中可以觀察到，在硫酸銨飽和度為25%時(shí)，酶以及雜蛋白都沒有沉淀，當(dāng)飽和度上升至40%時(shí)溶液中的蛋白逐步沉淀下來，當(dāng)飽和度到80%時(shí)酶和總蛋白提取率基本上一致，飽和度繼續(xù)上升，酶的提取率上升很少，而總蛋白的提取率則明顯上升，因此以80%飽和度作為沉淀?xiàng)l件是比較合適的。

表1 離子交換樹脂的初步篩選

3.2 離子交換樹脂的初步篩選

弱堿型離子交換樹脂D301K、D380、D303、強(qiáng)酸型離子交換樹脂001X7、弱酸型離子交換樹脂D151、D152靜態(tài)吸附12 h后洗脫結(jié)果如表1。

從表1觀察到右旋糖酐酶酶液經(jīng)過離子交換樹脂的吸附后，D301K洗脫液的蛋白濃度最高，但酶活回收率沒有相應(yīng)程度的提高，證明洗下來的雜蛋白比較多；D303和D151洗脫液在蛋白濃度較高的情況下，酶活回收率也很高。此外，強(qiáng)酸型離子交換樹脂001X7樣本有變渾濁且出現(xiàn)不溶物的現(xiàn)象，測(cè)定后發(fā)現(xiàn)離子交換吸附過程中pH下降幅度大，導(dǎo)致部分蛋白變性失活[5]，因此洗脫液中蛋白濃度出現(xiàn)明顯下降。綜合考慮，選取吸附效率相對(duì)較高的弱堿型離子交換樹脂D303和弱酸型離子交換樹脂D151繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)。

從來都是聽當(dāng)媽的自說自話：“她長(zhǎng)大了會(huì)感謝我的……”這是我第一次從一個(gè)孩子嘴里聽到真誠(chéng)的驗(yàn)證，這終于給一直糾結(jié)要不要當(dāng)虎媽的我找到了一個(gè)理由。

3.3 樹脂用量對(duì)右旋糖酐酶靜態(tài)吸附效果的影響

以不同用量的D303和D151對(duì)右旋糖酐酶吸附4 h，吸附后用稀鹽水進(jìn)行洗脫，測(cè)定洗脫液各項(xiàng)參數(shù)見表2和表3。

從表2可知D303用量上升時(shí)，溶液pH也隨之上升（酶液自身pH在5.5左右），但是右旋糖酐酶在中性偏堿性的環(huán)境下并不穩(wěn)定[11]。

表2 離子交換樹脂D303靜態(tài)吸附右旋糖酐酶

表3 離子交換樹脂D151靜態(tài)吸附右旋糖酐酶

當(dāng)D303加入量超過300 g/L時(shí)，pH上升幅度已影響了酶蛋白的穩(wěn)定，洗脫液中可測(cè)得的蛋白濃度出現(xiàn)了下降，酶蛋白回收率也同樣降低，證明已有酶蛋白變性失活。D151由于本身是弱酸性的離子交換樹脂，隨著用量的增多引起的pH變化并不大，依然維持偏弱酸的條件，有利于酶蛋白的穩(wěn)定，因此D151、D303最佳用量分別為400、200 mg/mL。此外，洗脫液透明澄清，去除了原來大部分的色素以及有氣味的雜質(zhì)。

3.4 吸附時(shí)間對(duì)右旋糖酐酶靜態(tài)吸附的影響

右旋糖酐酶酶液中加入200 mg/mL D303和400 mg/mL D151離子交換樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定上清剩余酶活變化趨勢(shì)見圖2。

圖2 吸附時(shí)間對(duì)右旋糖酐酶靜態(tài)吸附效率的影響

從圖2可以觀察到D151樣本吸收的酶蛋白較D303多，而且在5 h時(shí)已經(jīng)吸附了80%以上的酶蛋白，到24 h時(shí)，清液中的剩余酶活已經(jīng)不足5%。同時(shí)，D303樣本中剩余酶活還有50%以上，總體的吸附效率比D151要低。

3.5 洗脫鹽溶液種類對(duì)靜態(tài)洗脫效率的影響

以不同種類的鹽溶液對(duì)D151樹脂洗脫效果見表4。

表4 離子交換樹脂D151靜態(tài)吸附右旋糖酐酶

以不同濃度的鹽溶液對(duì)已吸附了右旋糖酐酶的樹脂進(jìn)行洗脫，取樣后計(jì)算出酶回收率，洗脫效果見圖3。從表4中可以看到，硫酸鎂和硫酸銨溶液并不能有效、專一地將目標(biāo)酶蛋白洗脫，因此氯化鈉溶液為最佳方案。

3.6 洗脫鹽溶液濃度對(duì)洗脫效率的影響

圖3 鹽溶液濃度對(duì)洗脫效率的影響

從圖3可以看到NaCl濃度超過200 g/L后，洗脫液中酶的回收率出現(xiàn)了下降。當(dāng)使用飽和氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫時(shí)，可以觀察到洗脫液中少量沉淀出現(xiàn)。另外，考慮到后續(xù)脫鹽操作，洗脫液的鹽濃度不宜過高，定在最低的200 g/L濃度進(jìn)行洗脫也是合適的。

3.7 洗脫時(shí)間對(duì)洗脫效果的影響

使用200 g/L濃度的NaCl溶液對(duì)吸附右旋糖酐酶后的樹脂進(jìn)行洗脫，按照時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣后，計(jì)算出酶回收率，結(jié)果如圖4。

圖4 吸附時(shí)間對(duì)右旋糖酐酶靜態(tài)吸附效率的影響

如圖4所示，洗脫時(shí)間的加長(zhǎng)，對(duì)提高酶的回收率沒有明顯的幫助，因此靜態(tài)洗脫條件控制在1 h為宜。

3.8 離子交換樹脂動(dòng)態(tài)洗脫純化右旋糖酐酶

按照2.8步驟所述，收集24管樣本后，測(cè)A280nm并記錄，所得洗脫曲線如圖5。

圖5 離子交換樹脂動(dòng)態(tài)洗脫右旋糖酐酶

從圖5中可以觀察到，在第4、5、6管中存在一個(gè)大的吸收峰，在第13管中也存在一個(gè)小的吸收峰，經(jīng)過酶活測(cè)定，只有第1個(gè)吸收峰有酶解反應(yīng)，說明此吸收峰為目標(biāo)峰。取第4管的樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果為單一條帶，分子量大致在66 KDa，與此前電泳結(jié)果相符（圖6）。

總結(jié)前述實(shí)驗(yàn)步驟，以取100 mL右旋糖酐酶發(fā)酵液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，初始酶活為10967.47 U/mL，比活力為8767.11 U/mg，經(jīng)過硫酸銨沉淀，超濾膜脫鹽以及樹脂動(dòng)態(tài)洗脫，回收率見表5。

4 結(jié)論

綜上所述，D151大孔型離子交換樹脂在純化右旋糖酐酶上有明顯效果，不僅體現(xiàn)在操作前后溶液中比活力的上升以及優(yōu)秀的吸附性能，而且在除去發(fā)酵液中帶來的異味和雜色也有相當(dāng)好的效果。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)使用的工程菌株為組成型表達(dá)同時(shí)使用無機(jī)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵液離心分離后即可獲得酶蛋白較高的原始酶液，方便后續(xù)處理。存在的問題是常用于離子交換樹脂洗脫的氯化鈉溶液，不能完全把吸附在樹脂的酶蛋白重新洗脫出來，靜態(tài)吸附中回收率不到60%，動(dòng)態(tài)吸附中則進(jìn)一步降低。

圖6 SDS-PAGE檢測(cè)

表5 右旋糖酐酶的回收率

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(本篇責(zé)任編校：朱滌荃)

Separation and Purification of Dextranase with Macroporous Ion Exchange Resin

LI Zhi-de, CHANG Guo-wei, HUANG Zeng-wei, ZENG Lian-qiang, LIANG Da-feng
(Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangzhou 510316)

Dextranase from recombinant Pichia pastoris was separated and purified by macroporous ion exchange resin. Results show that dextranase can be absorbed by D151 effectively. Dextranase absorption rate is 53.51% after four hours of static adsorption, it will be 95% after twenty-four hours. D151 is able to separate dextranase and hybridprotein. Specific activity of dextranase is 2.43 times after dynamic elution purification, but the recovery rate of dextranase is only 8%.

Dextranase; Macroporous; Ion exchange resin; Dextranase

TS24

A

1005-9695(2015)04-0058-07

2015-06-16；

2015-08-01

八桂學(xué)者建設(shè)工程專項(xiàng)、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助

*通訊作者：梁達(dá)奉(1964-)，男，博士，教授級(jí)高級(jí)工程師，國(guó)家甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位科學(xué)家，主要研究方向：制糖生物技術(shù)；

E-mail: ldfjt@126.com

黎志德，常國(guó)煒，黃曾慰，等. 大孔型離子交換樹脂分離純化右旋糖酐酶[J]. 甘蔗糖業(yè)，2015(4)：58-64.