湖北廣水蘿卜病毒病的分子鑒定與防治

袁偉玲 ，袁尚勇 ，甘彩霞 ，崔磊 ，鄧曉輝

（1.湖北省農(nóng)科院經(jīng)濟作物研究所，武漢，430064；2.湖北省蔬菜辦）

病毒病是蘿卜（Raphanus sativusL.）生產(chǎn)上的主要病害之一。蘿卜病毒病日趨嚴重，特別是夏秋季節(jié)為害更大，主要癥狀是輕重不等的花葉、黃點花葉、扭曲皺縮、矮化和壞死，最嚴重的全株死亡。據(jù)Ahlawat等[1]報道，蘿卜病毒病使肉質(zhì)根減產(chǎn)30.3%～100%，種子減產(chǎn)37.2%～95.8%。2014年10月湖北廣水市長嶺鎮(zhèn)近133 hm2蘿卜發(fā)生花葉病毒病，調(diào)查發(fā)現(xiàn)該主產(chǎn)區(qū)白玉春、美儂、天鴻春、漢白玉、雪單1號等8個主栽品種均發(fā)病，病情指數(shù)21～65（表1）。但在播種期和栽培條件基本相同的情況下，不同品種間的發(fā)病率有明顯差異，四月白、漢白玉、春不老發(fā)病率高，病情指數(shù)高；雪單1號、天鴻春發(fā)病較輕。

蘿卜病毒病的傳毒介體主要是蚜蟲。2014年10月以來，由于湖北廣水地區(qū)的長期高溫干旱，蚜蟲繁殖快，產(chǎn)生大量有翅蚜，有翅蚜在田間往返遷飛，進行試探性取食，將病毒在蘿卜植株間相互傳播，引發(fā)該地區(qū)蘿卜病毒病的大面積發(fā)生。

1 病毒種類分子鑒定

1.1 試驗材料

田間隨機選擇生長基本正常、無蟲害、具典型花葉癥狀的蘿卜植株30份，每份50～300 g。采集的蘿卜植株病害癥狀為黃綠相間不規(guī)則的嵌紋和條斑，長短大小不同，布滿整個葉片，發(fā)病程度為嚴重、一般、輕微和隱癥。同時對病樣采集地點無癥狀表現(xiàn)的植株也進行葉片樣品采集。

1.2 試驗方法

去除樣品表面的塵土和生物污染，放入保鮮袋運回實驗室，-80℃冰箱保存。根據(jù)相關文獻和基因庫中病毒的基因組序列，以 CP、MP、Nib、ORFI、ORFII核苷酸序列作為靶標，設計了鑒定病毒的多對特異引物，包括8種RNA病毒、3種DNA病毒以馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）的通用引物[2～4]。DNA、RNA提取參照王洪星等[5]的方法。根據(jù)引物說明，設置不同退火溫度和PCR反應程序，對疑似蘿卜病毒病樣品進行PCR/RT-PCR檢測。

表1 2014年湖北廣水各蘿卜品種病毒病發(fā)生情況

2 結果與分析

以提取的DNA為模板，分別采取3對DNA病毒引物進行PCR擴增，結果顯示，均沒有擴增條帶；以設計的RNA病毒引物進行RT-PCR擴增，結果表明，所檢測的蘿卜樣品中，黃瓜花葉病毒（CMV）所擴出的CP基因長度為764 bp，蕪菁花葉病毒（TuMV）所擴出的CP基因長度為333 bp，蠶豆萎蔫病毒（BBWV）所擴出的多聚蛋白基因長度為1 656 bp（圖1）。試驗結果表明，蠶豆萎蔫病毒是為害蘿卜的主要病毒；約有1/4的樣本是由2種或2種以上的病毒復合侵染，復合侵染病株中的病毒主要是蠶豆萎蔫病毒、蕪菁花葉病毒和黃瓜花葉病毒。

圖1 PCR檢測電泳圖

3 防治建議

①選擇抗（耐）病毒病蘿卜品種，如武青1號、魯蘿卜2號、春蘿l號、京紅1號、紅豐2號、衡陽半節(jié)紅、豫蘿卜1號等。

②適期晚播，避開高溫干旱敏感期。③避免與十字花科蔬菜連作、鄰作。

④加強苗期管理，如精細整地、播種，氮、磷、鉀肥配合施用，及時澆水，澆、鋤結合等，促進幼苗健壯，減輕病害。苗期做好蚜蟲、黃曲條跳甲、薊馬、白粉虱防治工作，干旱年份縮短蹲苗期，及時中耕除草，拔除病弱苗。

⑤藥劑防治可使用20%嗎啉胍·乙銅500倍液、0.5%抗毒劑1號水劑300倍液、1.5%植病靈乳油1 000倍液等藥劑噴霧，每隔5～7 d噴1次，連續(xù)2～3次。采收前5 d停止用藥。

[1]Ahlawat Y S,Chenulu V V.Losses to radish mosaic caused by strain of turnip mosaic virus and its control[J].Indian Phytopathology,1982,35（2）:255-260.

[2]Chen J,Chen J,Adams M J.A universal PCR primer to detect members of the Potyviridae and its use to examine the taxonomic status of several members of the family[J].Archives of Virology,2001,146（4）:757-766.

[3]McQualter P B,Bums P,Smith G R,et al.Molecular analysis of Fiji disease virus genome segments 5,6,8 and 10[J].Archives of Virology,2004（149）:713-721.

[4]Shamloul A M,Abdallah N A,Madkour M A,et al.Sensitive detection of the Egyptian species of sugarcane streak virus by PCR-probe capture hybridization（PCR-ELISA）and its complete nucleotide sequence[J].Journal of Virological Methods,2001（92）:45-54.

[5]王洪星，張雨良，羅志文，等.應用多重RT-PCR檢測甘蔗黃葉病毒和高粱花葉病毒[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2011，38（10）：128-131.