藥物分析高效液相色譜實(shí)驗(yàn)學(xué)生常見(jiàn)問(wèn)題分析及對(duì)策

曹婉 徐菁菁 曹君

摘要：高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）實(shí)驗(yàn)是藥物分析實(shí)驗(yàn)課程的重要組成部分。結(jié)合多年的教學(xué)科研實(shí)踐，對(duì)學(xué)生的HPLC實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了課堂調(diào)查，并對(duì)學(xué)生在稱量、樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備、流動(dòng)相的配置、色譜柱的安裝與平衡、色譜條件的設(shè)置及運(yùn)行等方面存在的問(wèn)題進(jìn)行了總結(jié)歸納，尋找問(wèn)題產(chǎn)生的根源，以期進(jìn)一步改進(jìn)和完善HPLC實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；實(shí)驗(yàn)教學(xué)；學(xué)生問(wèn)題；教學(xué)建議；藥物分析

中圖分類(lèi)號(hào)：G642.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2015）37-0245-02

藥物分析實(shí)驗(yàn)是全國(guó)高等醫(yī)藥院校藥學(xué)、化學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)教材之一，在培養(yǎng)學(xué)生具有創(chuàng)新能力的復(fù)合型人才中起到舉足輕重的作用，是理論聯(lián)系實(shí)際的重要環(huán)節(jié)[1，2]。通過(guò)本課程的學(xué)習(xí)，使學(xué)生重點(diǎn)掌握滴定法、分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）法等各種分析方法及實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基本原理在藥物分析中的實(shí)際應(yīng)用，同時(shí)培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鲬B(tài)度、良好的操作習(xí)慣，激發(fā)學(xué)生的求知欲望，挖掘?qū)W生的創(chuàng)新潛能，為從事藥品生產(chǎn)與質(zhì)量檢驗(yàn)、新藥研究開(kāi)發(fā)、臨床使用及監(jiān)督管理過(guò)程中的分析檢驗(yàn)等工作奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。隨著現(xiàn)代社會(huì)與科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)各種復(fù)雜樣品分離分析的要求越來(lái)越高，藥品質(zhì)量的分析檢測(cè)模式發(fā)生了巨大變化，HPLC技術(shù)逐漸成為一個(gè)主流的分析方法2。HPLC由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成，適用于分析沸點(diǎn)高、不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物，具有分離效能高、分析速度快及應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)?；贖PLC法的應(yīng)用特點(diǎn)，本文結(jié)合筆者自身教學(xué)實(shí)踐和科研，采用課堂跟蹤調(diào)查的方法對(duì)本校學(xué)生在完成HPLC實(shí)驗(yàn)中存在的經(jīng)常性、普遍性問(wèn)題進(jìn)行信息采集、問(wèn)題統(tǒng)計(jì)與分析。本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行闡述：

一、液相色譜實(shí)驗(yàn)中學(xué)生常見(jiàn)問(wèn)題

1.稱量。樣品的稱量是HPLC分析前非常關(guān)鍵的一步。正確的稱量，對(duì)維護(hù)電子天平的計(jì)量性能和延長(zhǎng)天平的使用壽命是至關(guān)重要的。在樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的稱量之前，電子天平的量程選擇非常重要。分析電子天平的量程通常有萬(wàn)分之一和十萬(wàn)分之一兩種選擇。通常，樣品的稱量選擇萬(wàn)分之一的量程，而標(biāo)準(zhǔn)品的稱量選擇十萬(wàn)分之一。有的學(xué)生在標(biāo)準(zhǔn)品的稱量時(shí)選擇了萬(wàn)分之一的量程，稱量的結(jié)果出現(xiàn)了偏差。在樣品的稱量時(shí)，有的學(xué)生選擇十萬(wàn)分之一的量程，認(rèn)為結(jié)果會(huì)更加準(zhǔn)確，其實(shí)沒(méi)有必要，因?yàn)闃悠返姆Q量的量比較大，達(dá)到克（g）級(jí)，萬(wàn)分之一量程足夠保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。在稱量時(shí)，有的學(xué)生未采用去皮法，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。在樣品稱量完成后，有的學(xué)生未及時(shí)清理稱量盤(pán)、關(guān)上分析天平的門(mén)、切斷電源、用天平罩蓋好天平，影響儀器的使用和精度。

2.樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置。在進(jìn)行HPLC分析前，待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備是非常重要的一步。在對(duì)樣品加溶液進(jìn)行超聲或稀釋處理時(shí)，有的學(xué)生使用燒杯或量筒進(jìn)行加液處理，忘記了HPLC是一個(gè)精密性要求高的實(shí)驗(yàn)，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)較大的偏差。在制備樣品溶液時(shí)，有的學(xué)生忘記了對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)濾或離心處理，很可能堵塞管路及色譜柱，影響儀器的使用和色譜柱壽命。

3.流動(dòng)相的配置。為保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，在HPLC分析中應(yīng)正確配置液相流動(dòng)相。溶劑的試劑規(guī)格主要有化學(xué)純、分析純、色譜純等幾種級(jí)別。有的學(xué)生在試劑級(jí)別的選擇上過(guò)于隨意，選擇分析純、甚至選化學(xué)純作為流動(dòng)相，對(duì)色譜柱或HPLC儀器造成損害，影響下次實(shí)驗(yàn)的使用。對(duì)一些含有緩沖鹽的溶液，有的學(xué)生圖省事，不進(jìn)行過(guò)濾，導(dǎo)致儀器泵壓升高，色譜柱和管路堵塞。對(duì)于流動(dòng)相的水相，應(yīng)選擇超純水新鮮配置，有些學(xué)生竟然選擇用放置許久的蒸餾水，導(dǎo)致基線較大波動(dòng)，實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。

4.色譜柱的安裝與平衡。在色譜柱安裝時(shí)，未注意到色譜柱的安裝方向，把色譜柱的進(jìn)口端和出口端裝反，極大減少色譜柱的壽命。在進(jìn)行樣品分析前，HPLC色譜柱的平衡至關(guān)重要。有的學(xué)生未用流動(dòng)相對(duì)分析色譜柱進(jìn)行充分平衡，檢測(cè)信號(hào)的基線波動(dòng)過(guò)大，無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確分析。

5.儀器色譜條件的設(shè)置及運(yùn)行。在液相色譜條件設(shè)置時(shí)，流速、柱溫、波長(zhǎng)、進(jìn)樣量等參數(shù)是保證分析結(jié)果成功的關(guān)鍵。有的學(xué)生在實(shí)驗(yàn)時(shí)，往往會(huì)遺漏一到二個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。在參數(shù)設(shè)置后，有的學(xué)生比較急，未等到儀器準(zhǔn)備就緒狀態(tài)，匆忙進(jìn)樣分析，導(dǎo)致操作失敗。

6.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理和記錄。有的學(xué)生在HPLC實(shí)際操作中對(duì)數(shù)據(jù)的記錄和處理出現(xiàn)的問(wèn)題較多，如對(duì)數(shù)據(jù)的含意及相互關(guān)系模糊不清，忽視單位之間的換算、原始數(shù)據(jù)記錄張冠李戴、數(shù)據(jù)的丟失、及未填寫(xiě)好儀器使用記錄等差錯(cuò)。

7.實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書(shū)寫(xiě)。在實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書(shū)寫(xiě)過(guò)程中，樣品和標(biāo)品的前處理過(guò)程記錄的過(guò)于簡(jiǎn)單，含量結(jié)果的計(jì)算未有公式和過(guò)程，甚至遺漏單位。有的書(shū)寫(xiě)不規(guī)范，字跡過(guò)于潦草，漏掉簽名等問(wèn)題。甚至有些學(xué)生在撰寫(xiě)報(bào)告時(shí)，不是根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)操作觀察到的現(xiàn)象得出的結(jié)論，而是根據(jù)實(shí)驗(yàn)教材中的相關(guān)理論推導(dǎo)得出結(jié)論，違背了實(shí)驗(yàn)的初衷。

二、液相色譜實(shí)驗(yàn)中學(xué)生常見(jiàn)問(wèn)題分析

在HPLC實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中，這些普遍問(wèn)題由于部分學(xué)生課前對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容未預(yù)習(xí)，學(xué)生自主學(xué)習(xí)能力差，對(duì)教學(xué)目的不甚了解。有些學(xué)生過(guò)分重視藥物分析理論課的學(xué)習(xí)，且實(shí)驗(yàn)課的占分比重較少，實(shí)驗(yàn)成績(jī)的高低對(duì)最終藥物分析課成績(jī)的影響不大，學(xué)生未引起足夠的重視。也有部分學(xué)生對(duì)HPLC實(shí)驗(yàn)課缺乏興趣，意識(shí)不到HPLC在整個(gè)藥物分析領(lǐng)域占有及其重要的地位，HPLC實(shí)驗(yàn)技能的高低是將來(lái)找工作成功的重要砝碼。有些學(xué)生的動(dòng)手能力不強(qiáng)，長(zhǎng)期養(yǎng)成一種只看不做的習(xí)慣。HPLC實(shí)驗(yàn)是分組操作，小組成員之間缺乏配合，各自為戰(zhàn)，團(tuán)隊(duì)意識(shí)薄弱。有的學(xué)生責(zé)任心不強(qiáng)，做完相關(guān)實(shí)驗(yàn)，忽視試劑、儀器的整理，隨意擺放，影響了其他學(xué)生的實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。有的學(xué)生粗心大意，造成玻璃儀器破損，藥品和標(biāo)樣污染，甚至釀成事故。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理和記錄出現(xiàn)的問(wèn)題主要在于理論基礎(chǔ)不扎實(shí)，沒(méi)有準(zhǔn)確理解相關(guān)知識(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理過(guò)于隨意，缺乏核對(duì)、驗(yàn)證、分析。實(shí)驗(yàn)記錄書(shū)寫(xiě)混亂、用詞缺乏準(zhǔn)確性、不規(guī)范，當(dāng)然與自己的語(yǔ)言表達(dá)能力也有關(guān)。當(dāng)然，HPLC實(shí)驗(yàn)易出現(xiàn)的問(wèn)題與老師的教學(xué)方法也密切相關(guān)。有的老師教學(xué)方法死板，缺乏啟發(fā)式、提問(wèn)式的教學(xué)方式，無(wú)法充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性。對(duì)HPLC色譜實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵操作講解不突出，不利于學(xué)生對(duì)知識(shí)的學(xué)習(xí)和掌握，缺乏對(duì)實(shí)驗(yàn)全程的有效監(jiān)督和指導(dǎo)。

三、液相色譜實(shí)驗(yàn)中教學(xué)改進(jìn)建議

首先，學(xué)生在HPLC實(shí)驗(yàn)課前，應(yīng)充分預(yù)習(xí)，先熟悉色譜基本理論知識(shí)，例如分離度、理論踏板數(shù)、拖尾因子、外標(biāo)法、面積歸一化法等術(shù)語(yǔ)意義。理出本次實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)，明確實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)，把不清楚的問(wèn)題記下來(lái)，做到心中有數(shù)。當(dāng)然，同學(xué)之間的相互交流也至關(guān)重要，可更好明確實(shí)驗(yàn)的目的和操作過(guò)程。在HPLC實(shí)驗(yàn)中，老師要改進(jìn)教學(xué)方法，豐富教學(xué)內(nèi)容，充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)積極性。同時(shí)創(chuàng)造條件讓每個(gè)學(xué)生盡可能地多動(dòng)手，多參與整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程。代課老師需要具有扎實(shí)的色譜理論知識(shí)，制定詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容計(jì)劃，實(shí)驗(yàn)器材和藥品放置在適合的位置，努力營(yíng)造能培養(yǎng)學(xué)生動(dòng)手能力的實(shí)驗(yàn)條件，打造一個(gè)規(guī)范化的HPLC教學(xué)實(shí)驗(yàn)室。老師也應(yīng)開(kāi)展專題講座，做好演示操作，每一步操作都必須認(rèn)真檢查，用正確、規(guī)范的操作去引領(lǐng)學(xué)生。特別對(duì)于HPLC實(shí)驗(yàn)中易出現(xiàn)的問(wèn)題，更應(yīng)逐一剖析，加深學(xué)生的認(rèn)識(shí)，盡可能避免下次犯同類(lèi)錯(cuò)誤。在本科生中，建立科研助理制度。利用學(xué)生的業(yè)余時(shí)間，鼓勵(lì)學(xué)生參加教師的科研課題，跟隨高年級(jí)本科生和研究生做實(shí)驗(yàn)，取得階段性成果后，及時(shí)總結(jié)和表?yè)P(yáng)。進(jìn)一步加強(qiáng)他們的觀察思維能力和實(shí)驗(yàn)動(dòng)手能力，提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力。理論聯(lián)系實(shí)際，大大提高學(xué)生的實(shí)際操作能力，對(duì)HPLC實(shí)驗(yàn)的促進(jìn)大有裨益，同時(shí)為將來(lái)的就業(yè)做好充分的準(zhǔn)備。在HPLC實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，應(yīng)引入多媒體教學(xué)技術(shù)。在以前的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，老師主要依靠板書(shū)和講解，對(duì)HPLC實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，學(xué)生會(huì)感到實(shí)驗(yàn)的枯燥和單調(diào)。多媒體動(dòng)畫(huà)的引入可增加學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，激發(fā)求知欲和好奇心，便于學(xué)生把握實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵操作點(diǎn)。合理的實(shí)驗(yàn)考核機(jī)制影響學(xué)生的學(xué)習(xí)效果和教學(xué)質(zhì)量反饋，藥物分析實(shí)驗(yàn)課的評(píng)分體系也應(yīng)改進(jìn)。傳統(tǒng)的HPLC實(shí)驗(yàn)教學(xué)考核往往依靠實(shí)驗(yàn)報(bào)告的評(píng)定，為一些不認(rèn)真完成實(shí)驗(yàn)、甚至不做實(shí)驗(yàn)的學(xué)生提供了可乘之機(jī)。在藥物分析HPLC實(shí)驗(yàn)課考核體系中，應(yīng)設(shè)置詳細(xì)而具體的量化指標(biāo)，如實(shí)際到課情況、動(dòng)手操作能力、實(shí)驗(yàn)報(bào)告、筆試、團(tuán)隊(duì)意識(shí)等項(xiàng)目均應(yīng)占一定比例，這樣可有效端正學(xué)生的實(shí)驗(yàn)態(tài)度，讓學(xué)生心中有數(shù)，認(rèn)真進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，有效提高HPLC實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)質(zhì)量。

總之，HPLC實(shí)驗(yàn)是藥物分析實(shí)驗(yàn)課的重要組成部分，是一項(xiàng)操作十分強(qiáng)的科目，又是培養(yǎng)學(xué)生動(dòng)手能力、創(chuàng)新意識(shí)的重要途徑。只有擺脫傳統(tǒng)的教學(xué)模式，創(chuàng)新HPLC實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，同時(shí)營(yíng)造一個(gè)良好的情感氛圍，全方位提高學(xué)生的實(shí)踐能力，適應(yīng)國(guó)家對(duì)培養(yǎng)高素質(zhì)人才的要求，將學(xué)生培養(yǎng)成優(yōu)秀的醫(yī)藥創(chuàng)新人才。

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