改進(jìn)的EBSS培養(yǎng)液與常用商品化試劑對鼠胚體外發(fā)育的影響

饒金鵬，金敏，金帆

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，浙江杭州 310052；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江杭州 310006

在體外環(huán)境中，胚胎自身不具備任何屏障和保護功能，溫度，濕度，塵埃，揮發(fā)性有機物（VOC），振動，噪音，光照等因素都會削弱胚胎的發(fā)育潛能[1]。而在諸多影響因素中，培養(yǎng)液是直接同胚胎接觸的最常用也是最重要的消耗品，其性質(zhì)直接決定著胚胎培養(yǎng)的結(jié)局[1-2]。小鼠胚胎生物學(xué)檢測（mouse embryo assay,EMA）作為實驗室質(zhì)量控制（quality control,QC）的常規(guī)方法，在評估IVF 實驗室培養(yǎng)液質(zhì)量方面得到了廣泛的應(yīng)用[3]。旨在對新建IVF 胚胎實驗室進(jìn)行質(zhì)量控制，同時探索胚胎培養(yǎng)液的性質(zhì)，該院生殖中心對簡單培養(yǎng)液EBSS 進(jìn)行了一定的改進(jìn)，并在2014年9月—2015年1月期間，將其應(yīng)用于鼠胚的體外培養(yǎng)，并與改進(jìn)前的EBSS 和另外兩種商品化序貫培養(yǎng)液在4 細(xì)胞胚胎，8 細(xì)胞胚胎，融合胚以及囊胚形成率上進(jìn)行了對比分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物 7 周齡雌性昆明系小白鼠（體質(zhì)量30～35 g），10周齡雄性小鼠（體質(zhì)量35～40 g），均購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，雌雄分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 藥物與試劑尿 促性素（HCG）與絨促性素（HMG）均購自麗珠制藥廠。簡單培養(yǎng)液EBSS 以及丙酮酸鈉，乳酸鈉及11 種氨基酸均購自SIGMA 公司，序貫培養(yǎng)液G1 和G2 以及配子處理液G-GAMETE 購自Vitrolife 公司，序貫培養(yǎng)液Quinn’s1026 和Quinn’s1029，人血清白蛋白（HSA）以及石蠟油均購自SAGE 公司。培養(yǎng)液均添加10%HSA，表面覆油后置于37 ℃,6.0%培養(yǎng)箱中平衡過夜。

1.2 實驗方法

1.2.1 改進(jìn)的EBSS 培養(yǎng)液的配制 卵裂培養(yǎng)液：向EBSS 中加入丙酮酸鈉并使其濃度達(dá)到0.4 mmol/L，加入乳酸鈉并使其濃度達(dá)到7 mmol/L，以及丙氨酸，天冬酰胺酸，甘氨酸，脯氨酸，絲氨酸等5 種非必需氨基酸并使其濃度均達(dá)到0.1 mmol/L；囊胚培養(yǎng)液：調(diào)節(jié)乳酸鈉濃度至5 mmol/L，加入丙氨酸，天冬酰胺酸，甘氨酸，脯氨酸，絲氨酸等5 種非必需氨基酸并使其濃度均達(dá)到0.1 mmol/L（同卵裂培養(yǎng)液），加入精氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，蘇氨酸，纈氨酸等6 種必須氨基酸并使其濃度達(dá)到0.25 mmol/L。

1.2.2 鼠胚獲取與培養(yǎng) 雌鼠腹腔注射10 IU 的HMG，48 h 后再注射HCG，注射后立即將雌雄按1:1 的比例合籠，48 h 后取胚。將孕鼠頸椎脫臼處死后用眼科剪取輸卵管放于覆油的G-GAMETE 配子處理液中，用1 mL 注射器針頭將輸卵管切割數(shù)次，擠出胚胎，再用拉細(xì)的巴斯德管將2 細(xì)胞鼠胚收集并隨機分裝到覆油的4 種不同培養(yǎng)液中，并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)胚胎培養(yǎng)到8 細(xì)胞階段，A 組將胚胎轉(zhuǎn)移到新配制并于前1 d 過夜平衡后的EBSS 培養(yǎng)液，B，C,D 3 組分別將胚胎從卵裂培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到經(jīng)過夜平衡的囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 鼠胚的觀察 觀察并記錄24 h 后4 細(xì)胞胚胎形成率，48 h后8 細(xì)胞或融合胚形成率，72 h 后囊胚形成率。

1.3 統(tǒng)計方法

用SPSS 19.0 分析軟件對所得計數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗。

2 結(jié)果

在2014年9月—2015年1月期間，該院新建IVF 胚胎實驗室共進(jìn)行11 個周期的鼠胚體外培養(yǎng)實驗，累計獲取2 細(xì)胞胚胎870 枚，其中形成囊胚共614 枚，總體囊胚形成率為70.57%。鼠胚培養(yǎng)分成4 個組別進(jìn)行，B，C，D 3 組的囊胚形成率顯著高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001)，4 個組別的胚胎發(fā)育情況及囊胚形成率詳見表1。鼠胚于覆油35 mm 皿中體外培養(yǎng)不同時期的生長情況見圖1。

表1 鼠胚在4 個組別不同培養(yǎng)液中不同階段的發(fā)育情況

圖1 2-細(xì)胞鼠胚于覆油35 mm 皿中體外培養(yǎng)不同時期的生長情況圖

3 討論

嚴(yán)格的實驗室質(zhì)量控制與質(zhì)量保障系統(tǒng)為胚胎的生長發(fā)育提供相對穩(wěn)定的場所，建立穩(wěn)定可靠的IVF 實驗室對于最大限度地維持胚胎發(fā)育潛能，維持IVF 成功率具有重要的作用[1]。在體內(nèi)，胚胎的外環(huán)境是輸卵管液和子宮分泌液，而在體外，胚胎的環(huán)境即是與其直接接觸的培養(yǎng)液。可以說，培養(yǎng)液的組分種類，組分含量和含量比，pH，滲透壓等直接決定了胚胎培養(yǎng)的結(jié)局[4]。為了檢測新建IVF 胚胎培養(yǎng)室是否達(dá)到人類胚胎培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，同時探索是否存在一種更加經(jīng)濟的培養(yǎng)液同樣能達(dá)到與常用商品化試劑相同或相近的胚胎培養(yǎng)效果，該院生殖中心對EBSS 進(jìn)行了改進(jìn)，并與其他兩種商品化培養(yǎng)液一起對昆明系小鼠胚胎進(jìn)行體外囊胚培養(yǎng)實驗。

通過對比簡單培養(yǎng)液EBSS 與兩種商品化序貫培養(yǎng)液的組成成分[1，5]，該研究發(fā)現(xiàn)簡單培養(yǎng)液EBSS 在無機鹽離子組分與濃度上與商品化培養(yǎng)液G1/G2，Quinn’s1026/Quinn’s1029 大 致 相同，說明3 種培養(yǎng)液都能對細(xì)胞內(nèi)的離子水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，以維持胚胎外環(huán)境滲透壓的穩(wěn)定。但在胚胎發(fā)育所必需的能量物質(zhì)方面，簡單培養(yǎng)液EBSS 僅含有葡萄糖及低濃度的丙酮酸鈉。由于處于早期分裂階段的胚胎代謝活動相對較弱，細(xì)胞的氧化及生物合成水平較低，故不能很好地利用葡萄糖，而只能利用丙酮酸和乳酸作為能量來源[6]，這也導(dǎo)致了僅以EBSS 作為培養(yǎng)液的大部分小鼠胚胎發(fā)育均阻止在2 細(xì)胞階段 （103 枚2 細(xì)胞中有71枚發(fā)育停滯，卵裂率僅為31.07%）。而簡單培養(yǎng)液EBSS 的另外一個不足之處是其不含氨基酸等復(fù)合成分。盡管有證據(jù)表明，人胚胎可以在缺少氨基酸的培養(yǎng)環(huán)境中生長[7]，但氨基酸具有作為蛋白質(zhì)類物質(zhì)生物合成前體，能量來源，參與調(diào)節(jié)胚胎能量代謝，調(diào)節(jié)滲透壓，調(diào)節(jié)pH，抗氧化，信息傳遞，調(diào)節(jié)胚胎分化和參與胚胎細(xì)胞基因表達(dá)等多種生物學(xué)功能[8-10]。而相關(guān)研究表明，在8 細(xì)胞期前，輸卵管中非必需氨基酸濃度最高，胚胎也主要消耗此類氨基酸，而在8 細(xì)胞期后必須氨基酸則能刺激內(nèi)細(xì)胞團的發(fā)育[11]，故胚胎在此階段則同時利用非必需氨基酸和必須氨基酸?？紤]到早期胚胎能量物質(zhì)及氨基酸在胚胎發(fā)育中的重要作用，再參照G1/G2 和Quinn’s1026/Quinn’s1029 的組分情況，我們對EBSS 進(jìn)行了必要的改進(jìn)（參見實驗方法1.2.1）。

鼠胚體外發(fā)育的結(jié)果顯示，改進(jìn)的EBSS 克服了2 細(xì)胞阻滯，在所獲得的198 枚2 細(xì)胞中，有177 枚發(fā)育到4-5 細(xì)胞階段，卵裂率為89.39%遠(yuǎn)高于未經(jīng)改進(jìn)的EBSS 31.07%，而在加入乳酸鈉和11 種氨基酸改進(jìn)成囊胚培養(yǎng)液后，其囊胚形成率72.22%也遠(yuǎn)高于改進(jìn)前的26.21%，這一結(jié)果與美國梅奧醫(yī)學(xué)中心的Morbeck 等最近在Fertility and Sterility 的研究報告顯示的用SAGE系列序貫培養(yǎng)液的鼠胚囊胚形成率75%，以及用Vitrolife 系列序貫培養(yǎng)液的培養(yǎng)結(jié)果78%相近[5]，而由于通過改進(jìn)后的EBSS 在成本上較之其他商品化培養(yǎng)液有大幅度的降低，說明其更經(jīng)濟，在鼠胚體外培養(yǎng)上具有更好的實用價值。

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