大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)與鑒定

張愛霞

1.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東梅州 514015； 2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程中心，廣東中山 510080

BMSCs 作為多能干細(xì)胞的一種，由于其取材方便，具有多向分化潛能，有較弱的免疫抗原性，體內(nèi)植入反應(yīng)較弱，正逐漸受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。BMSCs 不僅可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞等[1-2]中胚層來源的細(xì)胞，它還具有強(qiáng)大的橫向分化潛能，除了向間質(zhì)組織分化外，BMSCs 還可跨越胚層限制向外胚層的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等外胚層分化，向胰島樣細(xì)胞、肝細(xì)胞等內(nèi)胚層來源的細(xì)胞分化。BMSCs 的細(xì)胞增殖分裂模式使外源基因易于導(dǎo)入和表達(dá)，BMSCs 已成為重要的再生醫(yī)學(xué)種子細(xì)胞[3-4]，具有重要的臨床應(yīng)用前景。

體外成功分離培養(yǎng)BMSCs 是實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用的重要前提。該實(shí)驗(yàn)應(yīng)用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，并觀察其生物學(xué)特性及成骨和成脂的分化潛能，為BMSCs 的體內(nèi)外研究應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

4~6周齡SPF 級SD 大鼠，雌雄不限，體重100~150 g，購自中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

L-DMEM 培養(yǎng)基、H-DMEM 培養(yǎng)基均購自美國GIBCO BRL公司；胎牛血清（FCS）、胰蛋白酶均購自Hyclone 公司；Vitamin C、 地塞米松、 牛胰島素均購自Sigma 公司；β-甘油磷酸鈉購自Calbiochem 公司。兔抗大鼠單克隆抗體CD29-FITC、CD44-FITC、CD45- PE-Cy5 購自BD phamingen 公司。

1.3 大鼠BMSCs 的體外分離、培養(yǎng)與純化

取SPF 級3～4 周齡SD 大鼠，斷頸處死，75%酒精浸泡5 min。無菌條件下分離大鼠雙側(cè)股骨，并徹底清除附著其上的肌肉組織，去除兩端骨骺，用含10%胎牛血清的L-DMEM 間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞，1 100 r/min 離心5 min, 棄去上清及脂肪層。以2×105 cells/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后首次換液，以后每3 d 換液1 次，每天觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長情況。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記

收集第3 代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106個/mL，裝入1.5 mL的EP 管中，每管1 mL，1100 r/min 離心4 min，棄上清。每管加入100 μL PBS，混勻，分別加入CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5兔抗大鼠單克隆抗體1 μL（0.5~1 μg/106 細(xì)胞），混勻。37 ℃避光孵育20 min 后，每管加入1 mL PBS，1100 r/min 離心4 min，棄上清，再重復(fù)洗2 遍，以除去未結(jié)合抗體。0.5 mL PBS 重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。同時(shí)每管樣品設(shè)立同型陰性對照。

1.5 體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs 成骨和成脂分化

1.5.1 成脂分化及油紅O 染色鑒定 取第3 代的大鼠BMSCs 接種于六孔板，加入含1 umol/L 的地塞米松，0.5 mmol/L 的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，10 mg/L 的牛胰島素，100 mmol/L 的消炎痛(indomethncin)，10%FCS 的H-DMEM 誘導(dǎo)3 d，再用含10 mg/L的牛胰島素，10%FCS 的H-DMEM 處理1 d，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化和生長情況。成脂誘導(dǎo)后的細(xì)胞用PBS 洗滌3 次，10%多聚甲醛固定10 min，油紅O 染色5~10 min，60%異丙醇稍洗去多余染液，蒸餾水洗，Mayer 氏蘇木素淺染核，1%鹽酸水稍分化，水漂洗10 min。于倒置相差顯微鏡下觀察。

1.5.2 成骨分化及茜素紅S 染色 取第3 代的大鼠BMSCs 接種于六孔板，加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液 （含10~7 mol/L 地塞米松，10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，50 g/mLVitamin C）2 mL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。誘導(dǎo)分化18 d 后，吸去成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液，用PBS 洗滌3 次，然后加入適量的茜素紅-S 染液染10~15 min，顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 的形態(tài)學(xué)觀察

原代培養(yǎng)時(shí)，骨髓細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，細(xì)胞呈圓型，懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)24 h 后即有細(xì)胞貼壁，換液后可見短梭形、星形細(xì)胞分散貼壁生長，第4～5 d 可形成分散的細(xì)胞集落，細(xì)胞形態(tài)不一，梭形細(xì)胞為主，見圖1A。第8～9 d 細(xì)胞呈集落生長，細(xì)胞間相互緊密貼附生長，沿胞體長軸有序排列，呈螺旋狀或漩渦狀，可達(dá)80%~90%融合，見圖1B。消化傳代后，傳代細(xì)胞12 h 完全貼壁生長，3～4 d 可傳代1 次。傳代至第3 代的細(xì)胞形態(tài)均一，呈梭形生長，見圖1C。

圖1 不同時(shí)期骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察（×100）

2.2 BMSCs 表面標(biāo)記物的表達(dá)

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)的第3 代大鼠BMSCs CD29、CD44 表達(dá)陽性，而CD45 呈陰性，見圖2。

圖2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)

2.3 BMSCs 成脂成骨誘導(dǎo)分化及鑒定

BMSCs 加入脂肪誘導(dǎo)液誘導(dǎo)2 周后，細(xì)胞中有大小不等的脂肪滴出現(xiàn)，細(xì)胞逐漸由原來的梭形變?yōu)閳A形或多角形，經(jīng)油紅O 染色，蘇木素復(fù)染核，鏡下觀察可見脂滴為橙紅色，胞核為藍(lán)色，見圖3A。BMSCs 經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)2 周后，細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切渭?xì)胞，呈多層重疊生長，可觀察到較大的細(xì)胞結(jié)節(jié)，有明顯的鈣沉積，茜素紅S 染色后鏡下可見散在大量橘紅色的鈣結(jié)節(jié)，為茜素紅與鈣鹽形成的橘紅色的復(fù)合物，見圖3B。

圖3 大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成脂成骨誘導(dǎo)分化鑒定

3 討論

骨髓間質(zhì)干細(xì)胞是骨髓內(nèi)除造血干細(xì)胞之外的另一類干細(xì)胞，是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分。BMSCs 在全骨髓中比例很低，只占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的0.001%～0.01%[9]。目前已經(jīng)建立了多種體外分離培養(yǎng)BMSCs 的方法，主要有全骨髓貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選法和免疫磁珠分選法，不同的方法具有不同的優(yōu)缺點(diǎn)[1，10]。全骨髓貼壁培養(yǎng)法基于BMSCs 的粘附特性，是獲得這種細(xì)胞的最簡單方法。本實(shí)驗(yàn)采用的是全骨髓貼壁培養(yǎng)法，用L-DMEM + 10% FBS 作為基本培養(yǎng)基，通過反復(fù)、 多次換液去除未貼壁的造血干細(xì)胞，獲得貼壁生長的BMSCs，通過傳代進(jìn)行純化和擴(kuò)增培養(yǎng)。研究顯示，體外培養(yǎng)的BMSCs，在形態(tài)上呈紡錘形成纖維細(xì)胞狀，能貼壁生長，呈螺旋狀或漩渦狀[11]。該研究也證實(shí)了上述觀察結(jié)果。

BMSCs 的多向分化潛能受到多種因素的影響，研究表明，MicroRNA-9-1 可增加BMSCs 向神經(jīng)細(xì)胞的分化比率[12]，熟地含藥血清能夠促進(jìn)BMSCs 向神經(jīng)細(xì)胞的分化[13]。王貞等[14]研究發(fā)現(xiàn)，人血小板裂解液可以促進(jìn)BMSCs 成骨分化，抑制其成脂分化，朱小虎等[15]證實(shí)硝酸甘油也可促進(jìn)BMSCs 向成骨分化。BMSCs 的疾病治療方面也得到廣泛的研究，并取得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BMSCs 經(jīng)BMP-2 預(yù)誘導(dǎo)后移植治療大鼠再灌注后心肌梗死，對心肌梗死再灌注損傷有一定治療作用[16]。BMSCs 聯(lián)合腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子用于大鼠腦出血的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[17]，移植后可促進(jìn)大鼠腦出血損傷部位結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)。

該研究利用骨髓全貼壁培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)了大鼠BMSCs，所得細(xì)胞具有間質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，具有多向分化潛能，這將為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究和應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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