心痛方對急性心肌梗死大鼠血漿ICAM －1、VCAM －1的影響※

●熊 杜 范金茹 陳 彤 廖建萍 周斐然 王美香 肖正文 周 波 陳學(xué)娟

ACS是一組冠狀動脈粥樣硬化、斑塊破裂或糜爛、血栓形成或血管痙攣導(dǎo)致的急性或亞急性心肌缺血的臨床綜合征［1］。ICAM －1、VCAM －1起著轉(zhuǎn)運(yùn)白細(xì)胞粘附轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，在ACS的開始階段中起重要作用［2］。本研究以疏肝豁痰化瘀之心痛方對急性心肌梗死大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察其對給藥前后大鼠血漿ICAM－1、VCAM－1水平以及心肌梗死面積的影響，以探討炎癥反應(yīng)在ACS發(fā)病中的意義以及心痛方的療效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD雄性大鼠40只，體量180～250g，鼠齡8～10W，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司［許可證號SCXK(湘)2013－0003］。

1.2 主要儀器及試劑 酶標(biāo)儀:芬蘭(Labsystems Multiskan MS)，離心機(jī):微量高速離心機(jī)(德國heraeus公司)，呼吸機(jī):DH－140動物人工呼吸機(jī)(浙江醫(yī)科大學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)廠)，深低溫冰箱:中科美菱，培養(yǎng)箱:隔水式恒溫培養(yǎng)箱(德國 heraeus公司)，ICAM－1、VCAM－1抗體:由上?；鶢栴D生物科技有限公司提供，批號:201402。

1.3 藥物 心痛方(組成:柴胡10g、栝蔞10g、川芎10g、桃仁 10g、蒲黃 10g、白芥子 10g、郁金 10g、九香蟲5g、甘草5g;由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供)中藥超微顆粒按成人劑量換算成大鼠用量;單硝酸異山梨酯片(魯南貝特制藥有限公司生產(chǎn)，批號:08131012);水合氯醛(上海國藥集團(tuán)，批號:20130516)。

1.4 分組 將40只大鼠按體重分層，再隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、心痛方組、欣康組。

1.5 造模 采用冠脈結(jié)扎法［3］:大鼠稱重后，采用腹腔注射水合氯醛麻醉;麻醉滿意后備皮，術(shù)區(qū)碘酒消毒，行氣管插管(深度0.5～1cm)，連接呼吸機(jī)，調(diào)節(jié)呼吸頻率75次/min，呼吸時比1∶1，穩(wěn)定后，在左側(cè)胸部從右下至左上做一斜行切口開胸，在肺動脈圓錐與左心耳交界處下方2mm迅速以6－0線縫扎左前降支近端(進(jìn)針深度0.5mm，縫扎寬度為2mm左右)，以左心室前壁顏色變白和運(yùn)動減弱且心電圖顯示Ⅱ?qū)?lián)ST段弓背向上抬高≥0.1mv或出現(xiàn)病理性Q波為結(jié)扎成功的標(biāo)志，假手術(shù)組開胸但不結(jié)扎冠脈。

1.6 給藥 手術(shù)后均采用灌胃法給藥，心痛方組采用中藥超微顆粒沖調(diào)成湯劑按1.08g/kg劑量給藥;欣康組按0.87mg/kg分別用配好的藥液灌胃;模型組和假手術(shù)組分別給予灌服等量生理鹽水。連續(xù)7d，每天1次，于第7天灌胃30分鐘后處死大鼠。

1.7 指標(biāo)檢測 分別于術(shù)前、術(shù)后30分鐘、用藥1周以頸動脈取血法采血，留血樣至－70℃低溫冰箱保存待測，各抗體檢測參照Elisa試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 大鼠梗死面積測定 將摘取的心臟洗凈，放入冰箱中冰凍15分鐘后切成0.1～0.2cm厚的心肌片，放入NBT染色液，37℃溫孵15min，數(shù)碼相機(jī)拍攝心肌切片圖像，計算心梗部分占心肌橫斷面面積的百分比。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模 40只大鼠，實(shí)驗(yàn)中共有4只大鼠死亡，分別為假手術(shù)組1只，模型組2只，心痛方組1只。

2.2 心痛方對急性心肌梗死大鼠血漿ICAM－1表達(dá)的影響 術(shù)前各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);術(shù)后模型組、心痛方組、欣康組ICAM－1表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)，表明黏附分子ICAM－1參與到ACS的炎癥反應(yīng)過程;心痛方組和欣康組給藥后與模型組相比均能顯著降低ICAM－1(P＜0.01)，心痛方較欣康組更加明顯(P＜0.01)。見表1。

表1 心痛方對急性心肌梗死大鼠血漿中ICAM－1表達(dá)的影響(x± s，ng/l)

2.2 心痛方對急性心肌梗死大鼠血漿VCAM－1表達(dá)的影響 術(shù)前各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);術(shù)后模型組、心痛方組、欣康組ICAM－1表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)，表明黏附分子VCAM－1參與到ACS的炎癥反應(yīng)過程;心痛方組和欣康組與模型組給藥后相比均能顯著降低VCAM－1(P＜0.01)，二者VCAM－1的療效差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 心痛方對急性心肌梗死大鼠血漿中VCAM－1表達(dá)的影響(x± s，ng/l)

2.3 大鼠心肌梗死面積 心痛方組及欣康組心梗面積均見縮小(P＜0.01)，心痛方組在縮小心肌梗死面積上較欣康組更加明顯(P＜0.01)。說明心痛方與欣康均對心肌缺血有治療作用，且心痛方較欣康更有優(yōu)勢。見表3。

表3 各組間心梗面積的比較()

表3 各組間心梗面積的比較()

注:與模型組比較，#P＜0.01;與欣康組比較，*P＜0.01。

34.60±0.72心痛方組 9 1.08 22.51±0.90#*欣康組 10 8.7×10－4 26.86±0.78心梗面積模型組組別 n 藥物劑量g/kg 8－#

2.4 急性心肌梗死大鼠血漿中ICAM－1、VCAM－1表達(dá)與心肌梗死面積行多重線性回歸并建立二重線性回歸方程 心肌梗死大鼠血漿中ICAM、VCAM－1與心肌梗死面積回歸分析有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，表明血漿ICAM－1、VCAM－1濃度與心肌梗死面積有直接關(guān)系。ICAM－1、VCAM－1標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)為0.614、0.419，表明ICAM－1對心肌梗死面積的重要性相對 VCAM－1更高。共線性診斷:ICAM－1、VCAM－1的容忍度均為0.918;方差膨脹因子都為1.064可認(rèn)為不存在共線性問題。建立二重線性回歸方程:心肌梗死面積=0.679×(ICAM－1)+0.062×(VCAM－1)－13.901。見表4。

表4 急性心肌梗死大鼠血漿中ICAM－1、VCAM－1表達(dá)與心肌梗死面積多重線性回歸

3 討論

ICAM－1、VCAM－1主要表達(dá)于細(xì)胞表面。正常情況下，ICAM－1及VCAM－1在血管內(nèi)皮細(xì)胞和其它非造血細(xì)胞表達(dá)水平很低。血漿中ICAM－1與VCAM－1的濃度升高被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞活化和炎癥的標(biāo)志［4］。在ACS的反應(yīng)過程中，內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞等細(xì)胞ICAM－1和VCAM－1表達(dá)明顯增加，然后使單核細(xì)胞向內(nèi)膜移行致內(nèi)皮損傷，并促使單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮下成為巨噬細(xì)胞，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞［5］，在這一過程中粘附分子可能還介導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞、血小板間的起始黏附［6－7］，從多方面引起血管功能障礙。研究表明［8］:黏附分子在AS患者脂紋和斑塊中大量表達(dá)，與ACS的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。黏附分子介導(dǎo)白細(xì)胞黏附增加，可促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定性，削弱斑塊處的纖維帽，加速其破裂，血栓形成，導(dǎo)致不穩(wěn)定型心絞痛和心肌梗死的發(fā)生。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)受到抑制時，能阻止巨噬細(xì)胞向粥樣硬化斑塊處的聚集，并減少炎癥細(xì)胞釋放各類炎癥因子，達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)及延緩 ACS 進(jìn)展的目的［9］。

張仲景以“陽微陰弦”對胸痹心痛病因病機(jī)進(jìn)行了高度概括，陽微正虛是發(fā)病的根本，陰邪(痰飲、淤血等陰寒之邪)干犯是發(fā)病的重要條件。心痛方由柴胡、川芎、桃仁、蒲黃、栝蔞、白芥子、郁金、九香蟲、甘草等組成。柴胡為君，主入肝經(jīng)，長于疏肝解郁;栝蔞、白芥子、川芎、桃仁為臣，豁痰化瘀、通絡(luò)止痛;蒲黃、郁金為佐，輔助君藥及臣藥疏肝豁痰祛瘀;《本草綱目》言九香蟲“治脾腎虧損，壯元陽”故其能扶“陽微”;甘草調(diào)和諸藥。本方是取“急則治其標(biāo)”之意，重以疏肝解郁、豁痰化瘀，選藥重在標(biāo)實(shí)，而又兼顧正虛。

本研究結(jié)果推測心痛方可能是通過抑制ICAM－1、VCAM－1的表達(dá)從而抑制白細(xì)胞向內(nèi)皮的粘附、血小板活化及聚集，起到保護(hù)血管、心臟的作用。從這一方面印證中醫(yī)疏肝解郁、豁痰化瘀法治療胸痹心痛確有療效，為中醫(yī)治療ACS提供新的方向。

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