“氨在肝性腦病發(fā)病中的作用”家兔實(shí)驗(yàn)麻醉方法的改良

吳 衛(wèi)何慧華董 祁

廣州醫(yī)科大學(xué) 1 病理生理學(xué)教研室 2 機(jī)能學(xué)教研室 3 生理學(xué)教研室，廣東省廣州市 511436

“氨在肝性腦病發(fā)病中的作用”家兔實(shí)驗(yàn)麻醉方法的改良

吳 衛(wèi)1何慧華2董 祁3

廣州醫(yī)科大學(xué) 1 病理生理學(xué)教研室 2 機(jī)能學(xué)教研室 3 生理學(xué)教研室，廣東省廣州市 511436

我國(guó)各大醫(yī)科院校病理生理學(xué)傳統(tǒng)的“氨在肝性腦病發(fā)病中的作用”實(shí)驗(yàn)中，由于家兔的上腹部大型手術(shù)只是在局部麻醉下進(jìn)行，術(shù)中動(dòng)物掙扎強(qiáng)烈，故此實(shí)驗(yàn)一直受到不少師生的抵觸，個(gè)別院校甚至取消了該實(shí)驗(yàn)。本文旨在探討如何將靜脈麻醉方法有效運(yùn)用于該實(shí)驗(yàn)。適量注射短效巴比妥類藥硫噴妥鈉，輔以局部麻醉，既能保證動(dòng)物在安靜狀態(tài)下上腹部手術(shù)的順利完成，又不會(huì)明顯影響兔蘇醒后氨的中樞毒性作用的觀察。此改良麻醉方法值得在各大醫(yī)科院校推廣。

短效巴比妥類 硫噴妥鈉 急性氨中毒 家兔實(shí)驗(yàn) 肝性腦病

肝性腦病（Hepatic Encephalopathy，HE）是在急、慢性肝病基礎(chǔ)上發(fā)生的腦的神經(jīng)功能紊亂。維也納第11屆世界胃腸病學(xué)大會(huì)（1998）將肝性腦病分為A型（Acute急性）、B型（Bypass旁路）、C型（Cirrhosis肝硬化）。肝性腦病的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前主要存在氨中毒學(xué)說、假性神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說及γ－氨基丁酸（GABA）學(xué)說等。氨中毒學(xué)說認(rèn)為HE患者血氨升高，過量的氨對(duì)腦組織有毒性作用，包括使腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)平衡失調(diào)、干擾腦細(xì)胞能量代謝以及影響神經(jīng)細(xì)胞膜等，最終導(dǎo)致腦功能紊亂。氨中毒學(xué)說已成為解釋肝性腦病發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)，與其他學(xué)說之間的聯(lián)系越來越密切[1］。

1 麻醉方法改良的研究背景

我國(guó)各大醫(yī)科院校病理生理學(xué)及機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)開設(shè)的“氨在肝性腦病發(fā)病中的作用”本科實(shí)驗(yàn)課，旨在通過阻斷家兔的大部分肝臟血流，使肝功能嚴(yán)重?fù)p害，再經(jīng)十二指腸推注復(fù)方氯化銨液，致使家兔在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)類似肝性腦病的典型癥狀。此實(shí)驗(yàn)主要是復(fù)制A型肝性腦?。毙愿嗡ソ呦嚓P(guān)肝性腦?。┑膭?dòng)物模型，是病理生理學(xué)也是機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)唯一的一個(gè)消化系統(tǒng)疾病整體模型的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，它不僅可讓醫(yī)科學(xué)生深刻認(rèn)識(shí)到氨中毒學(xué)說在肝性腦病發(fā)病中的重要意義，而且通過實(shí)驗(yàn)組（甲兔：大部分肝葉結(jié)扎并灌氨）、假手術(shù)組（乙兔：肝葉假結(jié)扎并灌氨）、生理鹽水組（丙兔：大部分肝葉結(jié)扎并灌生理鹽水）的設(shè)計(jì)以及定量測(cè)定各組血氨，可有效地對(duì)學(xué)生進(jìn)行初步科研設(shè)計(jì)思維的訓(xùn)練。另外，此實(shí)驗(yàn)中包括的諸如荷包縫合、連續(xù)縫合、體外心臟穿刺取血等大量操作機(jī)會(huì)往往大大激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情。

為了排除靜脈麻醉藥對(duì)氨的中樞毒性作用的干擾，傳統(tǒng)上此實(shí)驗(yàn)的大型上腹部手術(shù)是在動(dòng)物局部麻醉（皮下浸潤(rùn)麻醉）下施行，因完全不能克服牽拉胃、肝、腸等內(nèi)臟引起的牽引痛和牽拉反應(yīng)，術(shù)中家兔掙扎異常劇烈，故長(zhǎng)期以來不少病理生理學(xué)以及機(jī)能學(xué)的帶教老師、技術(shù)員以及實(shí)驗(yàn)學(xué)生，對(duì)此有非常大的反感甚至抵觸情緒[2］。天津醫(yī)科大學(xué)病理生理室早已取消了在留學(xué)生中開展該實(shí)驗(yàn)課，大連醫(yī)科大學(xué)十年前已在其留學(xué)生教學(xué)中將此實(shí)驗(yàn)改為烏拉坦靜脈麻醉[3］。由于醫(yī)學(xué)科學(xué)研究越來越成為一種重塑人性的手段，為了研究疾病的機(jī)理，實(shí)驗(yàn)者要在動(dòng)物身上制造相應(yīng)疾病的模型。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)遵循替代、減少和優(yōu)化三大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)原則，其中的“優(yōu)化”原則即指通過改進(jìn)和完善試驗(yàn)程序、減少或減輕對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不人道操作，把對(duì)動(dòng)物的傷害降到最低限度[4］。具體而言，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)特別強(qiáng)調(diào)使用麻醉劑、無痛方法或者其他免除動(dòng)物疼痛的方法來減輕實(shí)驗(yàn)給動(dòng)物帶來的劇烈疼痛[5］。

基于上述研究背景，廣州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)及機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)的老師們近年來不斷對(duì)戊巴比妥鈉、烏拉坦、硫噴妥鈉等不同的靜脈麻醉藥在此實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)行摸索與研究，并取得了突破性的進(jìn)展。

2 常規(guī)靜脈麻醉方法之弊端

2.1 3%戊巴比妥鈉麻醉 常規(guī)劑量1ml/kg麻醉下，甲、乙兔不會(huì)出現(xiàn)全身陣發(fā)性抽搐及強(qiáng)直性痙攣。戊巴比妥鈉為中效巴比妥類，作用維持時(shí)間3～6h。巴比妥類的中樞抑制作用主要見于GABA能神經(jīng)傳遞的突觸，即主要通過延長(zhǎng)氯通道開放時(shí)間而增加Cl－內(nèi)流，引起突觸后神經(jīng)元超極化。由于戊巴比妥鈉的中樞麻醉機(jī)制與氨的中樞毒性機(jī)制有類似之處，家兔此實(shí)驗(yàn)中又一直處于麻醉狀態(tài)，故戊巴比妥鈉會(huì)明顯干擾氨的腦毒性作用。

2.2 25%烏拉坦麻醉 常規(guī)劑量即4ml/kg麻醉下，甲、乙兔出現(xiàn)撲翼樣震顫、局部及全身陣發(fā)性抽搐；減小劑量，如25%烏拉坦2ml/kg麻醉，甲、乙兔出現(xiàn)典型的類似角弓反張的強(qiáng)直性痙攣。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為烏拉坦是通過抑制乙酰膽堿酯酶的活性，造成乙酰膽堿的積累，影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物正常的神經(jīng)傳導(dǎo)而起麻醉作用，故它對(duì)中樞的抑制作用小。近年對(duì)烏拉坦的麻醉機(jī)制研究有了新進(jìn)展，認(rèn)為它是一種對(duì)多通道產(chǎn)生作用的麻酸劑，不僅加強(qiáng)乙酰膽堿受體功能，還可加強(qiáng)其他抑制性受體如GABA受體功能，同時(shí)還抑制興奮性受體[6］。由于烏拉坦使家兔在此實(shí)驗(yàn)中始終處于麻醉狀態(tài)，對(duì)甲、乙兔癥狀進(jìn)行解釋時(shí)，就很難排除烏拉坦的中樞干擾與影響。更值得一提的是，烏拉坦有潛在的致癌性。毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)烏拉坦有誘導(dǎo)鼠、兔致癌作用，故對(duì)人體同樣存在致癌的危險(xiǎn)性。早在上個(gè)世紀(jì)80年代初，我國(guó)衛(wèi)生部就明文規(guī)定將烏拉坦從醫(yī)用藥品中淘汰，禁用于病人，目前只允許在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉中使用，手術(shù)操作過程中也盡量不用未戴橡膠手套的手過多接觸動(dòng)物切口上的血液[7］。而“氨在肝性腦病發(fā)病中的作用”這個(gè)家兔實(shí)驗(yàn)近30min的上腹部大型手術(shù)中，實(shí)驗(yàn)者不可避免地要大面積接觸動(dòng)物腹腔內(nèi)臟及體液。

3 麻醉方法的改良

如何為本實(shí)驗(yàn)選擇一種合適的靜脈麻醉藥，既能保證家兔在安靜狀態(tài)下完成約25min的上腹部手術(shù)，又不會(huì)明顯影響對(duì)氨的中樞毒性作用的觀察。硫噴妥鈉（Thiopental Sodium）為超短時(shí)作用的巴比妥類藥物，作用維持時(shí)間0.25h，腦中半衰期僅5min，臨床用于短時(shí)手術(shù)[8］。如果硫噴妥鈉靜脈麻醉下完成家兔上腹部手術(shù)，術(shù)后家兔蘇醒，蘇醒后再灌注復(fù)方氯化銨溶液，是否能順利觀察到中樞氨中毒的典型癥狀？以此思路為出發(fā)點(diǎn)，筆者進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，并取得良好效果。

3.1 麻醉方法 兔耳緣靜脈緩慢注入2.5%硫噴妥鈉0.6ml/kg（即15mg/kg），上腹部0.2%普魯卡因皮下浸潤(rùn)麻醉，進(jìn)腹腔后進(jìn)行手術(shù)期間，如動(dòng)物有明顯不適，適量0.2%利多卡因表面麻醉。甲兔做大部分肝葉結(jié)扎及十二指腸插管術(shù)，乙兔做肝葉假結(jié)扎及十二指腸插管術(shù)。甲、乙兔20～25min后（即手術(shù)剛完成）蘇醒（出現(xiàn)主動(dòng)眨眼、四肢或脖子移動(dòng)等）。動(dòng)物蘇醒后，立即灌氨（每隔5min灌2.5%復(fù)方氯化銨溶液3ml/kg）。甲、乙兔均出現(xiàn)明顯呼吸加深加快，并漸出現(xiàn)四肢及尾巴的撲翼樣震顫、四肢展伸、局部及全身陣發(fā)性抽搐，轉(zhuǎn)為典型的類似角弓反張的強(qiáng)直性痙攣，最后呼吸停止而死亡。甲兔灌藥4次、乙兔灌藥5次出現(xiàn)強(qiáng)直性痙攣。相同灌氨量的前提下甲兔血氨水平高于乙兔。

硫噴妥鈉有抑制交感神經(jīng)、興奮迷走神經(jīng)的作用，易致呼吸抑制，靜脈注射時(shí)速度宜緩慢（兔：0.2ml/min）；并可使胃賁門括約肌松弛，易致誤吸和返流，故實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前夜最好禁食。

硫噴妥鈉為強(qiáng)堿弱酸鹽，pKa為7.6，故用生理鹽水（常偏酸）或PBS（中性）配制2.5%硫噴妥鈉溶液時(shí)，溶液常呈混懸狀，可用5%NaOH進(jìn)行微調(diào)，一旦溶液變清亮馬上停加NaOH，以免溶液過堿，靜脈注射刺激太大。

局部浸潤(rùn)麻醉和表面麻醉都屬于局部麻醉。表面麻醉是將穿透力強(qiáng)的局麻藥施用于黏膜表面，使其透過黏膜而阻滯位于黏膜下的神經(jīng)末梢，使黏膜產(chǎn)生麻醉現(xiàn)象。普魯卡因?qū)︷つさ拇┩噶θ?，而利多卡因穿透力?qiáng)，故本實(shí)驗(yàn)表面麻醉使用利多卡因。

3.2 改良麻醉方案下此實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵

3.2.1 切忌隨意靜脈追加硫噴妥鈉：硫噴妥鈉屬于巴比妥類藥物，中樞抑制作用主要見于GABA能神經(jīng)元，從而與氨的腦毒性機(jī)制有類似。如硫噴妥鈉麻醉過量，兔將難以蘇醒，在兔未蘇醒狀態(tài)下就灌氨而復(fù)制出的氨中毒模型，其癥狀的解釋將很難排除硫噴妥鈉的干擾和影響。硫噴妥鈉的安全用量（兔）為50mg/kg，常規(guī)麻醉劑量為15～30mg/kg，但為避免麻醉過深，筆者在此實(shí)驗(yàn)中只采用其下限值15mg/kg。這一靜脈麻醉劑量下可能對(duì)痛感的阻斷不夠，故需輔以上腹部皮下浸潤(rùn)麻醉，術(shù)中必要時(shí)還可在肝及胃腸等腹腔內(nèi)臟進(jìn)行表面麻醉。

3.2.2 局麻藥的使用要適度：用于腹腔內(nèi)臟表面麻醉的利多卡因，可經(jīng)腹腔吸收入血，然后透過血腦屏障而抑制中樞，如過量使用，一方面使動(dòng)物蘇醒延遲，另一方面易誘發(fā)氨的腦毒性作用提前出現(xiàn)（機(jī)制尚待探討）。臨床上安眠鎮(zhèn)靜藥就是肝性腦病的常見誘因之一。故上腹部手術(shù)過程中，實(shí)驗(yàn)員的操作要盡量輕柔，必要時(shí)才使用利多卡因，且1只兔最多使用1～2支利多卡因（1支規(guī)格為4mg/2ml）。

3.2.3 區(qū)分靜脈麻醉藥的麻醉時(shí)間和睡眠時(shí)間：睡眠時(shí)間指術(shù)后如不人為叫醒、動(dòng)物可持續(xù)睡眠的時(shí)間。硫噴妥鈉是脂溶性極高的藥物，脂溶性高的巴比妥類藥血漿蛋白結(jié)合率高，由腎小球?yàn)V過較少，也易被腎小球再吸收，其主要消除方式由肝藥酶代謝，因此，肝臟損傷極易使硫噴妥鈉的生物轉(zhuǎn)化受阻，從而使動(dòng)物的睡眠時(shí)間延長(zhǎng)[9］。硫噴妥鈉的麻醉時(shí)間為20～30min，但睡眠時(shí)間可達(dá)70～90min[10］。故術(shù)后如兔未及時(shí)蘇醒，可適度撥動(dòng)其身體促進(jìn)蘇醒。

除麻醉方法的改良及術(shù)后兔蘇醒后才開始灌氨，本實(shí)驗(yàn)的其他內(nèi)容均基本不變。硫噴妥鈉靜脈麻醉輔以局部麻醉的“氨在肝性腦病發(fā)病中的作用”實(shí)驗(yàn)，已于2015年上半年在廣州醫(yī)科大學(xué)本科生機(jī)能實(shí)驗(yàn)教學(xué)中正式開展，取得良好教學(xué)效果的同時(shí)，也積累了不少寶貴的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，希望本文能為病理生理學(xué)及機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)的同仁們起到拋磚引玉的作用。

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（編輯雅文）

S
tudy of Intravenous Anesthesia in Rabbit Experiment of Exploring the Role of Ammonia Intoxication in Pathogenesis of Hepatic Encephalopathy

WU Wei＊，HE Huihua，DONG Qi.＊Department of Pathophysiology，Guangzhou Medical University，Guangzhou City，Guangdong Province 511436

The classical medical undergraduate experiment of exploring the role of ammonia intoxication in the pathogenesis of hepatic encephalopathy has been debated for years and even cancelled because in this experiment the rabbit will struggle strongly during the upper abdominal surgery that is carried out only under the local infiltration anesthesia.In this paper，intravenous anesthesia drugs（such as urethane，pentobarbitol sodium）are discussed，with the purpose to discover an appropriate ones to be applied in this experiment.It is suggested that intravenous administration of thiopental sodium（a short－acting barbiturate），combined with local anesthesia，will not only make the rabbit to be more collaborative during the sugery but will also make the neuropsychical manifestations caused by acute ammonia intoxication duplicated after the awakening of rabbit be observed clearly.

Short－acting barbiturate，Thiopental sodium，Acute ammonia intoxication，Rabbit experiment，Hepatic encephalopathy

R－332

A

1001－7585（2015）22－3029－03

2015－06－23