DNA損傷修復機制和糖尿病造成的動脈粥樣硬化

曾　理(綜述)，丁群芳(審校)

(1.四川省醫(yī)學科學院 四川省人民醫(yī)院老年科，成都 610041； 2.四川大學華西醫(yī)院老年科，成都 610041)

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DNA損傷修復機制和糖尿病造成的動脈粥樣硬化

曾理1△(綜述)，丁群芳2※(審校)

(1.四川省醫(yī)學科學院 四川省人民醫(yī)院老年科，成都 610041； 2.四川大學華西醫(yī)院老年科，成都 610041)

摘要：動脈粥樣硬化及其所引起的心肌梗死、腦卒中、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)等是導致老年人病死率增加的重要原因。DNA損傷是激活DNA損傷修復路徑導致細胞早衰的重要原因，而動脈粥樣硬化中存在DNA損傷及DNA損傷修復機制參與的證據(jù)。糖尿病作為心血管疾病危險因素具有導致DNA損傷，從而加速血管老化的作用。該文綜述了動脈粥樣硬化疾病中DNA損傷和DNA雙鏈損傷修復機制的研究進展，從而為防治動脈粥樣硬化疾病提供新的思路。

關(guān)鍵詞：糖尿?。粍用}粥樣硬化；DNA損傷修復機制；細胞衰老

糖尿病是影響公眾健康的重大疾病，是以血糖升高并伴隨碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)等物質(zhì)代謝紊亂的疾病[1]。在罹患糖尿病的隨后幾年至幾十年間會出現(xiàn)多種并發(fā)癥[2]。目前全球大約有1億糖尿病患者，預計到2025年糖尿病患者將是現(xiàn)在的2倍[3-4]。許多研究證實，心血管疾病與糖尿病存在極強的聯(lián)系，糖尿病導致過量的非酯化脂肪酸、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗及內(nèi)皮源性一氧化碳減少，從而顯著增加動脈粥樣硬化的發(fā)生風險，導致心血管疾病的發(fā)生[5-6]。另一方面，動脈粥樣硬化斑塊中存在細胞衰老的證據(jù)，心血管疾病的危險因素也可能加速細胞衰老[7]。而DNA雙鏈損傷修復機制是細胞衰老的重要機制之一，現(xiàn)就DNA雙鏈損傷修復機制在糖尿病及血管損害中的作用進行綜述。

1細胞衰老的機制

細胞衰老是一種最基本的細胞行為，主要表現(xiàn)為細胞周期的永久性停滯及一系列特殊的細胞形態(tài)、功能和基因表型的變化[8]。Hayflick和Moorhead[9]最早于1961年提出復制性衰老的機制，該機制是依賴于端粒的縮短而產(chǎn)生的。細胞每發(fā)生一次分裂，端粒則縮短一段，當端粒縮短達到一定的片段時無法再縮短，將促發(fā)細胞停止分裂增殖，發(fā)生復制性衰老[10]。除了依賴端粒的細胞衰老機制外，研究發(fā)現(xiàn)，人成纖維細胞在低劑量的過氧化氫刺激下，細胞沒有出現(xiàn)端粒長度的縮短，但細胞老化β-半乳糖苷酶染色陽性比例增加[11]。與人成纖維細胞相比，雖然鼠胚胎成纖維細胞具有端粒更長、端粒酶活性更高的特性，但在20%高壓氧體外培養(yǎng)下，DNA損傷累積增加，細胞僅分裂數(shù)代即出現(xiàn)細胞周期停滯，而改為標準條件培養(yǎng)后該現(xiàn)象消失[12]?？梢?，與復制性衰老相比，這種細胞衰老并不是由于端?？s短造成的，而是由于發(fā)生了DNA損傷所導致的[12-13]。這種由電離輻射、化療藥物、內(nèi)源性活性氧及外源性應(yīng)激引起的DNA損傷所導致的細胞衰老稱為應(yīng)激性早衰[13]。

2糖尿病與氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激被認為是血管內(nèi)皮損傷的重要機制，高糖導致大量的氧自由基產(chǎn)生，而氧自由基又產(chǎn)生過氧硝酸鹽，這種強氧化劑穿過細胞膜使蛋白底物亞硝基化，從而降低抗氧化酶的活性；當氧自由基積累超過了抗氧化系統(tǒng)的清除能力時，氧化應(yīng)激會削弱或者降解一氧化氮的生物學活性，而一氧化氮生物活性減弱是導致心血管疾病發(fā)生的重要原因[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在5.5 mmol/L、11 mmol/L、22 mmol/L和33 mmol/L等不同糖濃度條件下培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞72 h，與正常糖濃度(5.5 mmol/L)相比較，高糖組細胞老化、β-半乳糖苷酶染色陽性率明顯增加，伴有活性氧水平增加及一氧化氮水平降低，且隨糖濃度上升有明顯變化[15]?？梢?，高糖可能通過氧化應(yīng)激和降低保護性因子一氧化氮，導致血管內(nèi)皮細胞發(fā)生應(yīng)激性早衰，從而導致血管內(nèi)皮細胞功能失調(diào)。

3DNA損傷修復機制

在正常細胞中，由于電離輻射、化療藥物、活性氧等原因發(fā)生DNA損傷后，都有相對應(yīng)的一系列復雜的機制糾正這種損傷，保持基因組的完整性，這些機制即為DNA損傷修復機制。DNA損傷修復路徑是一個錯綜復雜的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，其中毛細血管共濟失調(diào)突變基因(ataxia telangiectasia mutated,ATM)/細胞周期檢測點激酶(checkpoint kinase，CHK)2和Rad3相關(guān)蛋白(Rad3-related protein,ATR)/CHK1是兩條主要通路[16]。一旦DNA損傷發(fā)生，將激活ATM和ATR對損傷發(fā)生反應(yīng)。ATM主要感知DNA雙鏈損傷，ATR主要感知DNA單鏈損傷，某些情況下，ATR的激活也需要ATM的參與，因此ATM是DNA雙鏈損傷修復路徑中的主要感應(yīng)器[17]。當DNA雙鏈損傷發(fā)生時，ATM立即誘導組蛋白2A變異體(histone family 2A variant,H2AX)發(fā)生S139位點的磷酸化形成γ-H2AX[15],γ-H2AX在DNA雙鏈損傷過程中具有標志性的意義。當細胞發(fā)生DNA雙鏈損傷時，H2AX發(fā)生磷酸化并形成γ-H2AX焦點，所形成的γ-H2AX焦點和DNA雙鏈損傷在數(shù)量上基本呈1∶1的關(guān)系[18]。ATM/ATR繼續(xù)激活下游的檢測蛋白CHK1和CHK2，這兩種蛋白激酶將DNA損傷修復機制與細胞周期聯(lián)系在一起，它們通過多種機制使部分細胞周期蛋白依賴性激酶減少，以便控制細胞周期，但有些細胞周期蛋白需要下游的p53調(diào)控，因此CHK2發(fā)生磷酸化后，繼續(xù)誘導下游p53蛋白發(fā)生磷酸化，使磷酸化p53蛋白表達增高[19]。p53蛋白是一種腫瘤抑制因子，當DNA損傷時，體內(nèi)p53水平激增，促使一系列反應(yīng)發(fā)生，使細胞周期在進入S期前發(fā)生停滯，并激活一系列修復分子，進行DNA修復，防止錯誤信息繼續(xù)傳遞；當損傷無法修復時，則會導致細胞衰老或凋亡及腫瘤發(fā)生。

除了傳統(tǒng)信號通路參與DNA損傷修復反應(yīng)外，其他遺傳物質(zhì)也參與了該反應(yīng)的調(diào)解。微RNA(microRNA，miRNA)是近幾年在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。miRNA基因的轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物很快被核糖核酸酶Ⅲ家族酶Drosha加工成為miRNA前體，然后由細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中，經(jīng)Dicer酶識別剪切為成熟miRNA。研究發(fā)現(xiàn)，Dicer和Drosha對于激活DNA損傷反應(yīng)是必需的，而不是RNA干擾信號通路中的下游元件[20]。還發(fā)現(xiàn)，miRNA可對DNA損傷修復基因進行調(diào)控，miR-421通過直接與ATM的3′非編碼區(qū)信使RNA結(jié)合調(diào)節(jié)ATM的表達，改變細胞周期S期檢測點，同時增加細胞放射敏感性[21]。H2AX是miR-24調(diào)節(jié)的對象，miR-24過度表達可下調(diào)H2AX表達，使細胞對射線的敏感性增加[22]。miR-504和miR-125b通過與p53轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3′非編碼區(qū)結(jié)合，抑制p53的表達，使細胞對DNA損傷修復能力減弱[23-24]。

4DNA損傷修復機制與糖尿病所致動脈粥樣硬化

4.1糖尿病中DNA損傷及DNA損傷修復機制參與的證據(jù)Leinonen等[25]對81例病程>9年的非胰島素依賴型糖尿病患者24 h尿液進行分析發(fā)現(xiàn)，非胰島素依賴型糖尿病組的患者尿液中8-氧鳥嘌呤脫氧核苷(7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine，8-oxo-dG)的量與正常對照組相比顯著增加(P=0.001)，且尿液中8-oxo-dG的水平與糖化血紅蛋白水平呈正相關(guān)。在不同糖濃度(5.5 mmol/L、11 mmol/L、22 mmol/L和33 mmol/L)條件下培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞72 h后，發(fā)現(xiàn)隨著血糖濃度的增加，老化β-半乳糖苷酶染色陽性細胞比例增加，且γ-H2AX和磷酸化p53表達增加[15]。自發(fā)性糖尿病大鼠血中p53表達顯著升高，給予大鼠運動干預后，大鼠血糖顯著下降，同時伴有p53表達顯著下降[26]。分析12例胰島素依賴型糖尿病和15例非胰島素依賴型糖尿病患者外周血白細胞中8-oxo-dG的水平，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，胰島素依賴型糖尿病和非胰島素依賴型糖尿病組白細胞中8-oxo-dG的水平均顯著增加；同時，采用魯米諾化學發(fā)光檢測胰島素依賴型糖尿病和非胰島素依賴型糖尿病組活性氧水平，發(fā)現(xiàn)兩組平均活性氧水平與其相匹配的正常對照組相比顯著增加(P<0.01)[27]，表明糖尿病或高血糖可能通過氧化應(yīng)激導致DNA損傷增加。

4.2動脈粥樣硬化中DNA損傷及DNA損傷修復機制參與的證據(jù)Martinet等[28]對13例頸動脈狹窄>70%的患者頸動脈粥樣硬化斑塊進行研究發(fā)現(xiàn)，與人正常乳內(nèi)動脈相比，頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞中 8-oxo-dG 免疫組織化學染色表達呈強陽性(染色面積>90%)；從頸動脈粥樣硬化斑塊和人乳內(nèi)動脈標本中提取出染色體DNA進行分析，發(fā)現(xiàn)斑塊中8-oxo-dG的水平(160±29) 8-oxo-dG /105dG是對照組(3±1) 8-oxo-dG /105dG的55倍；同時，通過彗星實驗檢測DNA斷裂損傷，與正常乳內(nèi)動脈相比，頸動脈粥樣硬化斑塊中彗星尾部長度及尾矩均顯著增加，說明DNA斷裂損傷增加。Mahmoudi等[29]根據(jù)美國心臟學會疾病分級方法將50例頸動脈粥樣硬化患者按疾病程度分為Ⅰ～Ⅳ級，其頸動脈粥樣硬化斑塊免疫組織化學磷酸化ATM和γ-H2AX染色表達呈陽性，且隨著疾病嚴重程度增加磷酸化ATM和γ-H2AX呈陽性表達增加；與正常人血管平滑肌細胞相比，斑塊中分離出的血管平滑肌細胞免疫熒光染色顯示磷酸化ATM和γ-H2AX表達增加；彗星實驗發(fā)現(xiàn)DNA損傷增加。p53處于DNA損傷修復通路的下游，決定著細胞的最終結(jié)局，即衰老、凋亡或腫瘤發(fā)生。Miah等[30]對頸動脈粥樣硬化斑塊分析發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，斑塊中p53表達呈陽性。與無動脈粥樣硬化的血管相比，人頸動脈粥樣硬化的標本中與DNA損傷修復相關(guān)蛋白p53、磷酸化p53表達均增加[31]。Yuan等[32]對62例患者的頸動脈粥樣硬化斑塊進行分析，將斑塊類型分為無壞死核心、有壞死核心及斑塊破裂組，免疫組織化學顯示，3組均有p53表達，且有壞死核心及斑塊破裂組p53表達較無壞死核心組明顯；根據(jù)臨床癥狀分類分析，有短暫性腦缺血發(fā)作的患者斑塊中p53表達較無癥狀組顯著升高。有研究發(fā)現(xiàn)，356例有心血管疾病危險因素但無心血管疾病者的血漿中p53水平與其頸動脈的厚度存在正相關(guān)(r=0.594,P<0.01)[33]?？梢?，DNA損傷修復機制相關(guān)信號蛋白參與頸動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，并與頸動脈粥樣硬化病變嚴重程度相關(guān)。

4.3DNA損傷修復機制與動脈粥樣硬化的危險因素以高膽固醇飲食飼養(yǎng)雄性新西蘭大白兔24周后，血脂水平升高[總膽固醇(19.0±2.2) mmol/L、低密度脂蛋白膽固醇(15.3±2.5) mmol/L、三酰甘油(5.7±1.4) mmol/L]，同時伴有動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膜8-oxo-dG的表達強烈；改低脂飼養(yǎng)，分別于4周、12周、24周觀察，血脂水平顯著下降，低脂飼養(yǎng)24周后，高脂血癥可完全逆轉(zhuǎn)[總膽固醇(1.3±0.03) mmol/L、低密度脂蛋白膽固醇(1.7±0.2) mmol/L、三酰甘油(1.7±0.3) mmol/L]；同時，隨著低脂飼養(yǎng)時間的延長，兔胸主動脈內(nèi)膜8-oxo-dG的表達減少[28]。在一項臨床多中心隨機對照試驗中，納入110例患有代謝綜合征的女性，年齡55～80歲，長期教育并執(zhí)行低脂飲食或地中海飲食方式1年，該組人群尿中8-oxo-dG水平與對照組相比顯著降低(P<0.001)[34]。Kliemann等[35]對600例6～18歲青少年進行的研究發(fā)現(xiàn)，體質(zhì)指數(shù)、體脂水平、總膽固醇水平、低密度脂蛋白水平與彗星實驗中DNA損傷百分比呈線性正相關(guān)；每日攝入維生素C飲食后，DNA損傷減少，且每日維生素C攝入量與DNA損傷百分比呈線性負相關(guān)。高脂血癥可加劇DNA損傷，改善血脂及抗氧化治療可降低DNA損傷水平。

5小結(jié)

細胞衰老的機制可能參與動脈粥樣硬化的發(fā)生。DNA損傷加劇及DNA損傷修復機制的激活可能參與了細胞衰老及動脈粥樣硬化的過程。糖尿病、肥胖、高脂血癥等作為動脈粥樣硬化的危險因素，可能通過增加氧化應(yīng)激水平加速DNA損傷及DNA損傷修復機制的激活，從而引起細胞應(yīng)激性早衰及動脈粥樣硬化發(fā)生。對于DNA損傷及DNA損傷修復路徑的研究也可能為防治動脈粥樣硬化提供新的靶點。

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Advances in the Relationship between DNA Damage Repair Mechanism and Diabetic AtherosclerosisZENGLi1,DINGQun-fang2.(1.DepartmentofGeriatrics,SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople′sHospital，Chengdu610041，China; 2.DepartmentofGeriatrics,WestChinaHospital,SichuanUiversity，Chengdu610041，China)

Abstract:Atherosclerosis and the subsequent cardiovascular complications such as myocardial infarction,stroke,and coronary atherosclerotic heart disease are major causes of death among the elderly.DNA damage is the cause of the activation of the DNA damage repair pathway resulting in cell senescence,and the evidence that DNA damage and DNA damage repair mechanism participate in the process of atherosclerosis has been found in some studies.Diabetes,as a risk factor of cardiovascular disease,can lead to DNA damage,so as to accelerate the aging of blood vessels.Here is to make a review of the research development of DNA damage and DNA double strand damage repair mechanism,to provide a new method to prevent and treat atherosclerosis.

Key words:Diabetes; Atherosclerosis; DNA damage repair mechanism; Cellular senescence

收稿日期：2014-11-18修回日期：2015-03-31編輯：鄭雪

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.19.036

中圖分類號：R587.1

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)19-3553-04