hTERC基因檢測(cè)對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值及FISH技術(shù)檢測(cè)優(yōu)勢(shì)

呂 威(綜述)，曹志星(審校)

(珠海市第二人民醫(yī)院病理科，廣東珠海519020)

在女性生殖道腫瘤中，宮頸癌發(fā)病率位居首位［1］。在我國(guó)，其病死率僅次于卵巢癌，成為危害女性健康的首要疾病之一［2］。據(jù)德國(guó)、美國(guó)等研究報(bào)道，在過(guò)去的20年里，宮頸癌發(fā)病越來(lái)越年輕化;此外，我國(guó)吉林省的一項(xiàng)調(diào)查顯示，近年來(lái)，年齡＜35歲的年輕宮頸癌患者占宮頸癌總患者的比例顯著增加［3］?？梢?jiàn)，宮頸癌發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)，并具有全球普遍性。值得慶幸的是，宮頸癌的癌前病變期較長(zhǎng)，為 8～10年［4-5］。因此，對(duì)宮頸癌癌前病變進(jìn)行及時(shí)有效的篩查是降低宮頸癌發(fā)病率和病死率的關(guān)鍵。目前，利用熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybrid-ization，F(xiàn)ISH)對(duì)宮頸病變細(xì)胞中人類(lèi)染色體端粒酶(human telomerase RNA component，hTERC)基因的擴(kuò)增狀況進(jìn)行檢測(cè)，正在我國(guó)臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域逐漸開(kāi)展，現(xiàn)就其進(jìn)展?fàn)顩r及優(yōu)勢(shì)予以綜述。

1 宮頸病變

宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)被認(rèn)為是宮頸浸潤(rùn)癌的前期病變，它的發(fā)生與衛(wèi)生習(xí)慣及性生活混亂等因素密切相關(guān)，而病毒感染是其最根本的原因，如人類(lèi)乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染［6］。在絕大多數(shù)病例中，CIN并不好發(fā)于宮頸正常鱗狀上皮，反而多累及子宮頸鱗、柱交界處，即移行帶或交界帶［7］。傳統(tǒng)上，將CIN分為3級(jí):CINⅠ級(jí)相當(dāng)于輕度非典型增生(累及上皮層下部1/3)，CINⅡ級(jí)相當(dāng)于中度非典型增生(累及上皮層下部2/3)，而CINⅢ級(jí)相當(dāng)于重度非典型增生和原位癌(累及上皮層2/3以上至全層)［8］。目前，又提出了一種新的宮頸病變分類(lèi)系統(tǒng)，稱(chēng)為Bethesda分類(lèi)，該系統(tǒng)最初用于宮頸細(xì)胞學(xué)診斷，即鱗狀上皮內(nèi)病變;按Bethesda分類(lèi)可以分為低級(jí)別上皮內(nèi)病變和高級(jí)別上皮內(nèi)病變，低級(jí)別上皮內(nèi)病變相當(dāng)于CINⅠ級(jí)(以及某些HPV引起的不能診斷為CIN的病變)，而高級(jí)別上皮內(nèi)病變則相當(dāng)于CINⅡ級(jí)和CINⅢ級(jí)［9-11］。腫瘤細(xì)胞一旦突破基膜浸潤(rùn)至間質(zhì)，則表示宮頸上皮內(nèi)病變已進(jìn)展至宮頸浸潤(rùn)性癌。一般而言，處于CINⅠ級(jí)、CINⅡ級(jí)，甚至部分CINⅢ級(jí)的宮頸病變是可逆的，理論上完全可以通過(guò)篩查的方式及時(shí)發(fā)現(xiàn)宮頸上皮內(nèi)病變，從而進(jìn)行合理治療，降低其對(duì)女性的危害［6］。20世紀(jì)90年代，正是由于進(jìn)行了大規(guī)模的宮頸癌前病變篩查，才使我國(guó)宮頸癌的病死率與70年代相比，降低了63.64%［12］。可見(jiàn)，合理篩查對(duì)于宮頸病變的防范尤為重要。

2 hTERC基因

2.1 hTERC 基因與端粒酶 正常體細(xì)胞分裂一定次數(shù)后就進(jìn)入老化階段，失去復(fù)制能力，稱(chēng)為復(fù)制性老化。細(xì)胞的復(fù)制次數(shù)是由一種特殊的DNA重復(fù)序列控制的，它位于染色體末端，稱(chēng)為端粒。細(xì)胞復(fù)制一次，端粒就縮短一點(diǎn)，當(dāng)細(xì)胞復(fù)制一定次數(shù)和端粒縮短到一定程度后，就會(huì)被DNA修復(fù)機(jī)制(如“雙鏈DNA斷裂”)所識(shí)別，從而激活p53或視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因產(chǎn)物依賴(lài)的細(xì)胞周期G1期停滯或凋亡。而在生殖細(xì)胞和干細(xì)胞，由于端粒酶的存在可使縮短的端粒得以恢復(fù)，因此生殖細(xì)胞和干細(xì)胞具有十分強(qiáng)大的自我復(fù)制能力。腫瘤細(xì)胞，尤其在惡性腫瘤中，幾乎能無(wú)限復(fù)制，這與端粒酶表達(dá)增加有關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明，85%～95%的人類(lèi)惡性腫瘤細(xì)胞均有一定程度的端粒酶活性，而人體正常細(xì)胞幾乎沒(méi)有此活性［13］(145-146)。端粒酶是一種具有逆轉(zhuǎn)錄活性的、依賴(lài)RNA的DNA聚合酶，將自身RNA作為模板，通過(guò)向端粒末端添加序列(TTAGGG)的方式維持端粒的長(zhǎng)度，從而使細(xì)胞能夠持續(xù)復(fù)制，得以永生。端粒酶主要包含人端粒酶RNA、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人端粒酶相關(guān)蛋白1三部分，這些結(jié)構(gòu)的共同存在、協(xié)同作用使端粒酶能發(fā)揮永生化細(xì)胞的功能。其中，端粒酶的主體結(jié)構(gòu)是hTERC，它的編碼基因位于3號(hào)染色體長(zhǎng)臂，此基因的擴(kuò)增使宮頸細(xì)胞極易發(fā)生非典型性發(fā)育異常，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)閷m頸癌，這一觀點(diǎn)已在2005年被美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院的一項(xiàng)關(guān)于宮頸癌的研究所證實(shí)［14-15］。可見(jiàn)，hTERC基因在調(diào)控端粒酶活性及促使宮頸腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用。

2.2 hTERC基因與HPV HPV是一種DNA病毒，它的基因組是雙鏈的，呈閉合環(huán)狀，其基因組大致包含3個(gè)基因區(qū):上游調(diào)控區(qū)、早期編碼蛋白區(qū)(E1、E2、E4、E5、E6、E7)和晚期編碼蛋白區(qū)(L1、L2、E4、E5)。根據(jù)HPV感染的不同后果，可將其分為低危型和高危型，低危型HPV感染可在數(shù)月至數(shù)年內(nèi)被清除，并不引起宮頸病變，甚至沒(méi)有任何臨床癥狀，只是“一過(guò)性”的;而高危型HPV的持續(xù)性、慢性感染則與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［16］。低危型HPV可引起生殖道乳頭狀瘤和癌前病變，其亞型主要包括HPV-6和HPV-11，且病毒的基因組尚未整合到宿主細(xì)胞DNA中;而在宮頸癌，高危型HPV-16或HPV-18的基因組已與宿主細(xì)胞的DNA進(jìn)行整合，提示病毒DNA的整合對(duì)于加速腫瘤的發(fā)生、發(fā)展非常重要，不僅如此，整合的高危型病毒基因組在同一腫瘤的所有癌細(xì)胞中均在同一位置，提示整合方式是克隆性的;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其整合位點(diǎn)總是在E1/E2開(kāi)放閱讀框架內(nèi)，E2區(qū)的中斷使HPV-16或HPV-18的E6和E7蛋白過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而擴(kuò)增的E6和E7蛋白可與p53蛋白結(jié)合并導(dǎo)致后者降解，從而激活端粒酶，抑制細(xì)胞凋亡;或干擾p53基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)對(duì)hTERC基因及端粒酶的激活產(chǎn)生協(xié)同作用，促進(jìn)癌癥發(fā)生［13(153)，17］。Hopman等［18］的實(shí)驗(yàn)結(jié)論便充分印證了上述理論，他們用FISH方法檢測(cè)宮頸病變中hTERC基因擴(kuò)增和HPV整合情況的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)hTERC基因隨著病變的加重，擴(kuò)增率逐漸提高，且在hTERC基因擴(kuò)增的病例中，HPV整合突出，提示hTERC基因擴(kuò)增和HPV整合呈正相關(guān)，進(jìn)而推測(cè)hTERC基因的擴(kuò)增及端粒酶的激活可能與HPV致癌機(jī)制密切相關(guān)。

3 FISH

FISH的理論基礎(chǔ)為核酸雜交，狹義的FISH指DNA-DNA雜交，廣義的FISH指DNA-DNA和DNA-RNA雜交。無(wú)論狹義還是廣義，均利用被檢樣本細(xì)胞中核酸序列與探針的互補(bǔ)性進(jìn)行雜交，最終在熒光顯微鏡下觀察是否有熒光信號(hào)表達(dá)以及表達(dá)數(shù)值的多少而得出結(jié)果。FISH包括直接法和間接法，直接法以熒光素直接標(biāo)記已知探針，經(jīng)過(guò)標(biāo)本與探針的共同變性、雜交及漂洗等步驟后，可直接在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果;而間接法在標(biāo)本與探針經(jīng)歷變性、雜交、漂洗之后，將熒光標(biāo)志物同時(shí)與已知探針及其特異性抗體結(jié)合，進(jìn)而放大待檢信號(hào);目前FISH已從單色發(fā)展至雙色甚至多色，這使觀察者能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)核酸序列有無(wú)異常［19］。FISH的實(shí)驗(yàn)材料可以是細(xì)胞涂片、冰凍組織切片或常規(guī)石蠟包埋組織切片等［13］(513)。由于FISH操作重復(fù)性好，具有很高的特異性和敏感性，目前已越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，如膀胱癌、乳腺浸潤(rùn)癌等的基因檢測(cè)中。

4 FISH檢測(cè)hTERC基因在宮頸病變中的應(yīng)用與優(yōu)勢(shì)

研究表明，采用FISH檢測(cè)宮頸細(xì)胞hTERC基因的擴(kuò)增率，可作為CIN由低級(jí)別進(jìn)展到高級(jí)別的指標(biāo)，還可以提高宮頸癌前病變的篩查率，是一種損傷較小的、比較可靠的檢測(cè)手段［20-23］。此外，任飛飛等［24］將直接涂片法、液基、石蠟切片等不同制片方法進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)hTERC基因的宮頸癌篩查中，宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查制片法明顯優(yōu)于其他方法;但hTERC基因雜交成功率以石蠟包埋組織切片最高，為85.7%，同時(shí)，其熒光信號(hào)滿(mǎn)意率也最高，且在指導(dǎo)宮頸病變及宮頸癌的治療中，石蠟包埋組織切片法的染色體破壞最小，實(shí)際意義更大。目前，除FISH檢測(cè)宮頸病變中hTERC基因的擴(kuò)增情況外，宮頸病變篩查的主要方式還包括肉眼觀察、宮頸細(xì)胞學(xué)檢測(cè)、HPV檢測(cè)及陰道鏡檢查等。其中，肉眼觀察范圍較局限，易漏診頸管內(nèi)病變，同時(shí)檢查記錄難以保存，質(zhì)控困難;細(xì)胞學(xué)檢查是一種形態(tài)學(xué)檢查，受觀察者專(zhuān)業(yè)知識(shí)、經(jīng)驗(yàn)等主觀因素的影響，有時(shí)難以作出客觀、準(zhǔn)確的診斷［25］;針對(duì)HPV感染的檢測(cè)雖靈敏度高達(dá)84%～100%，但其特異度只有64%～95%，而且也只能檢測(cè)出檢查當(dāng)時(shí)的HPV狀態(tài)，其實(shí)大多數(shù)婦女，特別是性生活活躍的年輕女性，HPV感染只是暫時(shí)的，在一段時(shí)間內(nèi)會(huì)自然轉(zhuǎn)陰，并不會(huì)引發(fā)宮頸癌，這使HPV陽(yáng)性的預(yù)測(cè)意義較低［26］;而陰道鏡檢查雖然無(wú)創(chuàng)、操作方便、可重復(fù)，但有研究表明，其檢出高級(jí)別上皮內(nèi)病變的靈敏度和特異度分別為19.1%和91.6%，檢出低級(jí)別上皮內(nèi)病變的靈敏度和特異度分別為82.1%和58.7%，提示陰道鏡不適合作為篩查使用［27］。綜上所述，鑒于宮頸癌篩查的關(guān)鍵性和重要性，急待尋找其他檢測(cè)方法以彌補(bǔ)上述方法的不足。應(yīng)用FISH檢測(cè)hTERC基因的優(yōu)勢(shì)包括:①重復(fù)性好，定位準(zhǔn)確;②敏感性與特異性高;③結(jié)果直接清晰，易于判讀。

5 小結(jié)

研究顯示，hTERC基因擴(kuò)增陽(yáng)性的患者治療后病變復(fù)發(fā)率較陰性的患者高［28-29］，由此可知，應(yīng)用FISH檢測(cè)hTERC基因的擴(kuò)增情況，不僅可用于宮頸病變篩查，還有可能作為預(yù)后指標(biāo)。另外，將hTERC基因在宮頸病變及病變旁組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，從而試圖在宮頸病變旁組織中找到一個(gè)合適的距離作為安全手術(shù)范圍，最大可能降低復(fù)發(fā)率?？梢?jiàn)，F(xiàn)ISH檢測(cè)hTERC基因的應(yīng)用將在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以其突出的優(yōu)勢(shì)發(fā)揮更大的作用。

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