重癥肌無力實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

楊俊超(綜述)，文穎娟(審校)

(陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽712046)

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種神經(jīng)肌肉接頭傳遞性功能障礙所引起的自身免疫性疾病，這種疾病病變部位主要在神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上乙酰膽堿受體(acetylcholine receptors，AchR)，表現(xiàn)為神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜上的AchR自身抗體介導(dǎo)的特異性自身免疫疾病，由于抗體阻斷了這種神經(jīng)肌肉的信號傳遞，產(chǎn)生了部分或全部骨骼肌易疲勞，呈波動(dòng)性肌無力，活動(dòng)后加重、休息后減輕、晨輕暮重等癥狀。為了進(jìn)一步對人類MG發(fā)病機(jī)制有充分的認(rèn)識(shí)，以便針對其不同的發(fā)病機(jī)制制訂相應(yīng)的緩解或治療方案，現(xiàn)對近年來實(shí)驗(yàn)性MG動(dòng)物模型的制備進(jìn)行綜述。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在免疫實(shí)驗(yàn)中作為人類的替身將在很大程度上影響實(shí)驗(yàn)研究的成敗。常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔和豬。大鼠由于抵抗傳染能力較強(qiáng)，在國內(nèi)生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用和使用數(shù)量已超過小鼠而居首位。近交Lewis大鼠由于MG模型制備的易患性較強(qiáng)而作為目前常用大鼠［1］，且其發(fā)病有急性期和緩解期，表現(xiàn)為一種快速的發(fā)病進(jìn)程故而適用于實(shí)驗(yàn)研究。小鼠由于具有代表性的免疫系統(tǒng)，容易人為選擇性地控制小鼠的免疫條件，區(qū)分淋巴細(xì)胞的不同功能亞群，得到近交系群體等特點(diǎn)，所以也常用于免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中。唐冰杉等［2］研究指出，近交系C57BL/6小鼠是比較公認(rèn)的MG高敏感鼠，在免疫生物學(xué)中近交系小鼠C57BL/6是最為常用的小鼠。所以根據(jù)選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的近似性、重復(fù)性和均一性原則，動(dòng)物種系的選擇現(xiàn)多采用無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級別的近交Lewis大鼠和近交系C57BL/6小鼠。

1.2 動(dòng)物的性別和年齡選擇 醫(yī)學(xué)專家在大量的臨床觀察后指出，MG患者以20～40歲多見，女性略多于男性，占全部病例的55%～60%［3］，這可能與雌激素水平有關(guān)，故在誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性MG(experimental autoimmune MG，EAMG)的實(shí)驗(yàn)中絕大多數(shù)選擇雌性動(dòng)物。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模研究中，根據(jù)自身性免疫原理，B淋巴細(xì)胞對AchR的記憶作用會(huì)導(dǎo)致年齡大的小鼠的肌無力模型建立成功率下降，但是這種記憶反應(yīng)可被誘導(dǎo)弱化，即在初次抗原致敏后行再次免疫接種可提高小鼠的致病率，所以MG模型建立多采用適齡的小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象［4］。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備方法

2.1 以AchR全蛋白為免疫原建立EAMG動(dòng)物模型 以AchR全蛋白為免疫原建立模型的方法國外很早就開始使用，1973年P(guān)atrick等［5］首先從電鰻電器官提取純化 AchR免疫接種新西蘭大白兔后制成了主動(dòng)免疫的自身免疫性EAMG模型，后來在大鼠、小鼠中用同樣方法也制備了EAMG模型。這種從加利福尼亞電鰻器官中提取AchR是種天然的抗原，含有多個(gè)抗原決定簇，具有良好的免疫原性，能有效激活宿主的免疫系統(tǒng)［6］，但提取率低、提純的過程復(fù)雜而且昂貴，故而此種模型制備方法難以普及推廣使用。

2.2 采用合成AchR多肽片段為免疫原建立動(dòng)物模型 由于天然AchR全蛋白不易獲取，所以開始嘗試用人工合成的方法來獲取蛋白，并且取得了比較理想的結(jié)果。早在20世紀(jì)80年代，Lennon等［7-8］用人工合成的電鰻 α 亞單位上的AchRα125-147接種Lewis鼠來誘導(dǎo)EAMG模型，在觀察MG臨床變化的同時(shí)做遲發(fā)型超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，免疫的Lewis大鼠都有抗肽鏈抗體產(chǎn)生，出現(xiàn)了MG的臨床癥狀和電生理改變，T淋巴細(xì)胞能識(shí)別 AchRα125-147并產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生肌無力的癥狀。

近年來，Baggi等［9-10］用大鼠AchR亞基多肽片段在Lewis大鼠上成功地誘導(dǎo)了EAMG模型，發(fā)現(xiàn)效果很好，陽性率達(dá)73.3%。孫辰婧［11］用重組人AchRα中提取的AchR肽段片段來免疫大小鼠取得了和全蛋白免疫相似的效果，都誘導(dǎo)出了典型的肌無力模型癥狀。孟和寶力高和額爾敦［12］通過使用AchRα亞甲基基因片段聯(lián)合白細(xì)胞介素6 DNA免疫原誘導(dǎo)Lewis鼠建立 EAMG模型，都取得了非常好的效果。Sun等［13］使用改進(jìn)的方法重復(fù)性的重組人類骨骼肌AchR胞外域，獲得了大量的子代受體，可誘導(dǎo)出EAMG，探索出了更加方便、經(jīng)濟(jì)的模型建立方法。

2.3 其他建立動(dòng)物模型方法 除上述兩種方法外，后來又出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移MG患者血清建立動(dòng)物模型的方法，即用肌無力患者的血清及血清內(nèi)成分注射到小鼠體內(nèi)成功的建立出肌無力的動(dòng)物模型［14］。包忠雷和閆曉波［15］在MG動(dòng)物模型建立中提出，用處于急性期EAMG大鼠的AchR-Ab注射到Lewis大鼠來制備模型，但是此類模型不能從自身性免疫機(jī)制上模擬MG的發(fā)病情況，故而在臨床研究上都有一定局限性。Losen等［16］用雜交瘤技術(shù)制備AchR-mAb單克隆抗體并誘導(dǎo)Lewis大鼠建立模型，出現(xiàn)了對外界刺激反映遲鈍，體質(zhì)量突然下降，成功地用 mAb35、mAbA7、mAbG10［17-18］等誘導(dǎo)制作出了EAMG動(dòng)物模型。Richman等［19］發(fā)現(xiàn)，受體絡(luò)氨酸激酶是神經(jīng)突觸受體的組成和功能維持的重要物質(zhì)，并通過抵抗這種酶活性制備了肌無力模型。雖然這些模型制備方法都有成效，也有一定的臨床意義，但是尚處于實(shí)驗(yàn)研究階段，還沒有建立起一套完善和規(guī)范的方案，穩(wěn)定性和可重復(fù)性的把控還有待進(jìn)一步研究。

3 評價(jià)動(dòng)物模型建立的指標(biāo)類型

3.1 臨床肌力評分方法標(biāo)準(zhǔn) Lennon等［20］在20世紀(jì)80年代已經(jīng)制訂出了比較科學(xué)的肌力評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分級方法，即將癥狀嚴(yán)重程度分為4級:0級，沒有肯定的無力表現(xiàn);1級，撕咬無力，四肢力量較差，在光滑地面上前肢打滑，活動(dòng)減少且易疲勞;2級，明顯無力，休息時(shí)身體呈隆起姿勢，頭尾下垂，大腿外展，前肢趾彎曲，動(dòng)作笨拙，行走不穩(wěn);3級，嚴(yán)重?zé)o力表現(xiàn)，無撕咬動(dòng)作，肌肉震頗，呼吸困難，瀕死或死亡。這種肌力的評價(jià)為以后評判標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范化奠定了基礎(chǔ)。雖然這種觀察法操作簡單，但是主觀性較強(qiáng)，容易產(chǎn)生評分級別誤差。近年來提出一種強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)法，即強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)來觀察疲勞程度，如強(qiáng)迫動(dòng)物反復(fù)抓握測量抓握肌力的抓握法，強(qiáng)迫動(dòng)物游泳并記錄時(shí)間的游泳法和測量動(dòng)物翻轉(zhuǎn)懸掛的停留時(shí)間的翻轉(zhuǎn)懸掛法。趙斌和劉降光［21］通過翻轉(zhuǎn)懸掛法測量動(dòng)物的肌力情況，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)單因素方差分析得出了較為顯著的結(jié)果，使肌力的評判變得更為客觀。

3.2 AchR 抗體(AchR antibodies，AchR-Ab)的測量 AchR-Ab是最早發(fā)現(xiàn)的MG患者的檢測指標(biāo)之一，在MG診斷中已經(jīng)作為一項(xiàng)最重要指標(biāo)。EAMG患者血清中抗體的數(shù)量會(huì)明顯增多，雖然并非患者均會(huì)有血清抗體陽性反應(yīng)，但是在發(fā)病的絕大多數(shù)患者體內(nèi)，AchR-Ab還是一個(gè)關(guān)鍵的檢測指標(biāo)，同時(shí)其滴度的大小還與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，因此抗體的檢測一直受到高度重視，也已經(jīng)建立了標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法，即酶聯(lián)免疫吸附法。這種方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、所用試劑穩(wěn)定、容易標(biāo)準(zhǔn)化、批量化操作等優(yōu)勢，已經(jīng)得到了廣泛的定性和定量分析。Liu等［22］通過實(shí)驗(yàn)研究表明，肌無力大鼠血清的免疫球蛋白含量增多，并提出減少免疫球蛋白的半衰期來治療肌無力。

3.3 血清膽紅素和尿酸的測量 周霞和孫中武［23］通過氧化酶定量分析法對MG患者血清膽紅素和尿酸水平的檢測，結(jié)果顯示，MG患者血清中間接膽紅素、總膽紅素和尿酸水平均顯著低于正常水平。這為評定MG模型的建立提供了更多的檢測方法，為MG的治療提供了新的思路和依據(jù)。

3.4 細(xì)胞免疫因子水平的檢測 Bakhiet等［24］在EAMG動(dòng)物模型體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，輔助性的Th1細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素γ、腫瘤壞死因子α等細(xì)胞因子可以活化B細(xì)胞，使EAMG癥狀加重。Feferman等［25］通過抑制肌無力模型動(dòng)物體內(nèi)的干擾素來減輕肌無力的癥狀取得了良好效果，Th2細(xì)胞分泌抗炎性細(xì)胞因子能減輕EAMG癥狀，而Th3細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子β可以調(diào)節(jié)EAMG的癥狀表現(xiàn)。Uzawa等［26］對血清中的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素15進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞因子在MG患者中明顯比正常人高，所以也可作為疾病檢測指標(biāo)之一。

3.5 肌電圖電衰減反應(yīng)的檢測 對于MG患者，肌電圖是常用的具有確診價(jià)值的診斷方法，在MG患者中有80%在低頻刺激時(shí)為陽性，且與病情輕重相關(guān)。肌電圖電衰減反應(yīng)的檢測是目前最能反映神經(jīng)肌肉接頭神經(jīng)電生理變化的檢查方法。

3.6 骨骼肌病理形態(tài)學(xué)觀察 王輝和張平［27］通過彩色細(xì)胞圖像分析儀TJTY-400TC測量EAMG動(dòng)物神經(jīng)末梢面積、突觸前后膜長度及其比值、突觸前后膜面積，結(jié)果顯示，神經(jīng)末梢(突觸前膜)變小、突觸間隙增寬，平均突觸后膜面積減小、突觸后膜長度變短，突觸后膜與前膜長度比值變小并且可見突觸后膜皺褶喪失或減少，AchR密度減少，殘余的突觸后膜皺褶中有抗體和免疫復(fù)合物的沉淀。Serra等［28］通過實(shí)驗(yàn)表明，AchR形態(tài)的改變和Na+通道的異常會(huì)影響神經(jīng)肌肉接頭處信號傳遞，產(chǎn)生肌無力癥狀。宋雅芳等［29］、文穎娟和李志華［30］和文穎娟等［31］研究發(fā)現(xiàn)，MG患者的肌肉組織結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化且線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)目也會(huì)發(fā)生變化。另外，韓磊等［32］研究發(fā)現(xiàn)，MG患者的骨骼肌中線粒體跨膜電位會(huì)隨著后膜的損傷而降低。因此，這種通過透射電鏡和流式細(xì)胞儀對線粒體檢測也成為比較可信的檢測依據(jù)。

4 問題與展望

MG實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立已經(jīng)取得了很大進(jìn)步，并且出現(xiàn)了多種模型制備方法，但也存在一些問題:①肌無力模型建立的方法雖多但不統(tǒng)一，沒有探索出一套操作簡單、復(fù)制率高、廉價(jià)容易推廣的方法。②模型建立的不夠典型，模型評判標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，沒有形成一套能很客觀地評價(jià)模型成功與否的衡量標(biāo)準(zhǔn)。③檢測的指標(biāo)也不夠多樣和合理，雖然很多指標(biāo)可以作為肌無力的檢測指標(biāo)，但是沒有探索出其發(fā)病的根本機(jī)制和根本變異參數(shù)指標(biāo)。④現(xiàn)有研究建立的EAMG動(dòng)物模型的造模方法所需時(shí)間都較長，研究發(fā)病迅速的MG動(dòng)物模型的制備方法也將是一個(gè)新的方向。近年來有研究表明［33］，MG模型不僅出現(xiàn)了四肢肌肉肌無力現(xiàn)象，還出現(xiàn)了因心肌和呼吸肌衰亡的致死現(xiàn)象，胃腸平滑肌的功能障礙出現(xiàn)胃腸蠕動(dòng)性障礙的現(xiàn)象，以及眼瞼下垂眼球運(yùn)動(dòng)障礙的現(xiàn)象，這將為模型的建立和肌無力機(jī)制的探討提供更多的方向、方法。并且近年來MG檢測方法也越來越多，涉及到線粒體、肌肉生成調(diào)控因子和基因片段損傷等多個(gè)領(lǐng)域，這將為進(jìn)一步研究MG的發(fā)病機(jī)制以及探索MG治療提供新的方向。

［1］關(guān)潔賓，陳忠平，李放花，等.30所醫(yī)科院校學(xué)報(bào)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2000，21(2):135-137.

［2］唐冰杉，楊明山，曹學(xué)兵.實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力動(dòng)物模型的研究概況［J］.國外醫(yī)學(xué):神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊，2002，29(3):265-268.

［3］姚健.胸腺切除治療重癥肌無力療效及影響因素的分析［D］.長春:吉林大學(xué)，2005.

［4］朱麗君.重癥肌無力動(dòng)物模型的建立及中藥治療重癥肌無力的機(jī)制研究［D］.長春:吉林大學(xué)，2011.

［5］Patrick J，Lindstrom J，Culp B，et al.Studies on purified eel acetylcholine receptor and anti-acetylcholine receptor anti-body［J］.Proc Nat Acad Sci，1973，70(12):3334-3338.

［6］Sanders DB，Schleifer LS，Eldefrawi ME，et al.An immunologically induced defect of neuromuscular transmission in rats and rabbits［J］.Ann N Y Acad Sci，1976，274:319-336.

［7］Lennon VA，Griesmann GA，McCormick DJ，et al.Definition of myasthenogenic Sites of the Human acetylcholine Receptor Using Synthetic Peptides［J］.Ann N Y Acad Sci，1987，505:439-450.

［8］Lennon VA，Mc Comick DJ，lambert EH，et al.Region of peptide 125-147 of acetyl chorine receptor alpha subunit is exposed at neuromuscular junction and induces experimental auto antibodies［J］.Proc Nail Acad Sci U S A，1985，82(24):8805-8809.

［9］Baggi F，Annoni A，Ubiali F，et al.Immunization with rat，but not Torpedo-derived 97-116peptide of the AchR alpha-subunit induces experimental myasthenia gravis in Lewis rat［J］.Ann N Y Acad Sci，2003，998:391-394.

［10］Baggi F，Annoni A，Ubiali F，et al.Breakdown of tolerance to a self-peptide of acetylcholine receptor α-subunit induces experimental myasthenia gravis in rats［J］.J Immunol，2004，172(4):2696-2703.

［11］孫辰婧.誘導(dǎo)重癥肌無力模型新方法并研究可溶性促衰變因子對其保護(hù)作用［D］.西安:第四軍醫(yī)大學(xué)，2013.

［12］孟和寶力高，額爾敦.AChR-α亞基基因片段聯(lián)合IL-6 DNA免疫大鼠建立實(shí)驗(yàn)性重癥肌無力模型［J］.免疫學(xué)雜志，2010，26(6):531-532.

［13］Sun C，Zhang H，Xu J，et al.Improved methodology to obtain large quantities of correctly folded recombinant N-terminal extracellular domain of the human muscle acetylcholine receptor for inducing experimental autoimmune myasthenia gravis in rats［J］.Arch Med Sci，2014，10(2):389-395.

［14］Burges J，Vincent A，Molenaar PC，et al.Paassive transfer of seronegative myasthenia gravis to mice［J］.Muscle Nerve，1994，17(12):1393-1400.

［15］包忠雷，閆曉波.重癥肌無力動(dòng)物模型的建立［J］.中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2010，17(1):6971.

［16］Losen M，Stassen MH，Martinez-Martinez P，et al.Increased expression of raspy in muscles prevents acetylcholine receptor loss in experimental autoimmune myasthenia gravis［J］.Brain，2005，128(10):2327-2337.

［17］Duan RS，Adikari SB，Huang YM，et al.Protective potential of experimental autoimmune myasthenia gravis in lewis rats by IL-10-modified dendritic cells［J］.Neurobiol Dis，2004，16(2):461-467.

［18］梁芙乳，高楓.重癥肌無力的自身抗體及機(jī)制［J］.國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科雜志，2006，33(4):346-346.

［19］Richman DP，Nishi K，F(xiàn)erns MJ，et al.Animal models of antimuscle-specific kinase myasthenia［M］.Ann N Y Acad Sci，2012，1274:140-147.

［20］Lennon VA，lindstrom JM，Seybold ME，et al.Experimental autoimmune myasthenia gravis model of rats and guinea pigs［J］.J Exp Med，1975，141(6):1365-1375.

［21］趙斌，劉降光.胸腺五肽對實(shí)驗(yàn)性重癥肌無力小鼠模型免疫功能的影響［D］.天津:天津大學(xué)，2007.

［22］Liu L，Garcia AM，Santoro H，et al.Amelioration of experimental autoimmune myasthenia gravis in rats by neonatal FcR blockade［J］.J Immunol，2007，178(8):5390-5398.

［23］周霞，孫中武.重癥肌無力患者血清膽紅素和尿酸變化及其意義［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2013，93(17):1287-1291.

［24］Bakhiet M，Yu LY，Ozenci V，et al.Modulation of immune responses and suppression of experimental autoimmune myasthenia gravis by surgical denervation of the spleen［J］.Clin Exp Immunol，2006，144(2):290-298.

［25］Feferman T，Aricha R，Mizrachi K，et al.Suppression of experimental autoimmune myasthenia gravis by inhibiting the signaling between IFN-gamma inducible protein 10(IP-10)and its receptor CXCR3［J］.J Neuroimmunol，2009，209(1/2):87-95.

［26］Uzawa A，Kawaguchi N，Himuro K，et al.Serum cytokine and chemokine profiles in patients with myasthenia gravis［J］.Clin Exp Immunol，2014，176(2):232-237.

［27］王輝，張平.神經(jīng)肌肉疾病的臨床與病理［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007:296-301.

［28］Serra A，Ruff R，Kaminski H，et al.Factors contributing to failure of neuromuscular transmission in myasthenia gravis and the special case of the extraocular muscles［J］.Ann N Y Acad Sci，2011，1233:26-33.

［29］宋雅芳，胡任飛，劉友章，等.健脾祛濕方對重癥肌無力模型大鼠骨骼肌線粒體及神經(jīng)肌肉接頭處超纖維結(jié)構(gòu)的影響［J］.中藥藥理與臨床，2010，26(1):65-68.

［30］文穎娟，李志華.葛根芩連湯及其拆方對UC大鼠結(jié)腸平滑肌線粒體跨膜電位的影響［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，35(6):68-72.

［31］文穎娟，周永學(xué)，王江.基于“線粒體-肌肉-脾”探討脾胃失調(diào)與重癥肌無力發(fā)病的關(guān)系［J］.現(xiàn)代中藥，2013，33(5):25-28.

［32］韓磊，李鳴皋，馬貴喜，等.血管緊張素對內(nèi)皮細(xì)胞和線粒體跨膜電位的影響［J］.中國公共衛(wèi)生雜志，2009，25(1):51-53.

［33］焦健.黃芪復(fù)方湯劑治療脾腎虛損型Ⅱ型重癥肌無力臨床研究52例［D］.沈陽:遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2011.