蒸發(fā)光散射檢測器在中藥分析中的應(yīng)用

·綜述·

蒸發(fā)光散射檢測器在中藥分析中的應(yīng)用

曹邦靜1，蘇娟2，葉霽2，林珊3，張衛(wèi)東2(1.江西中醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330004；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122)

[摘要]目的總結(jié)蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)在天然藥物分析中的優(yōu)勢和應(yīng)用情況。方法對有關(guān)ELSD在中藥分析中應(yīng)用的文獻進行綜述。結(jié)果蒸發(fā)光散射器在中藥分析、中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、指紋圖譜、多譜聯(lián)用技術(shù)及高通量篩選方面都有較廣泛的應(yīng)用。結(jié)論ELSD具有廣泛的應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞]蒸發(fā)光散射檢測器；中藥分析

[作者簡介]曹邦靜，碩士研究生.Tel:13918220650；E-mail：caobangjing@163.com

[通訊作者]張衛(wèi)東.Tel:(021)81871244；E-mail：wdzhangy@hotmail.com

[中圖分類號]R917[文獻標(biāo)志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.01.004

[收稿日期]2013-03-28[修回日期]2013-12-04

Application of evaporative light scattering detector in analysis of natural drugs

CAO Bangjing1，SU Juan2，YE Ji2，LIN Shan3，ZHANG Weidong2(1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China;2.The Second Military Medical University，Shanghai 200433，China;3.Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350108，China)

Abstract[]ObjectiveTo summarize the advantage and application of evaporative light scattering detector(ELSD) for the analysis of natural drugs.MethodsThe application of ELSD in natural medicine analysis was reviewed in the article.ResultsELSD in analysis of natural drugs，natural drugs quality standards research，fingerprint，multi-spectrum combination technology and high-throughput screening had been widely applied.ConclusionEvaporative light scattering detector had a broad application prospect.

[Key words]evaporative light scattering detector；quantitation of natural drugs

蒸發(fā)光散射檢測器(evaporative light scattering detector，ELSD)是一種通用型質(zhì)量檢測器，與紫外檢測器、熒光檢測器、示差折光檢測器、質(zhì)譜檢測器和核磁共振檢測器共同用于檢測自然界中幾乎所有的物質(zhì)，可彌補在HPLC中應(yīng)用最廣的紫外檢測器對檢測物質(zhì)必須具有吸收紫外光的生色團的要求。ELSD作為一種濃度型檢測器，在無紫外或紫外末端吸收的未知化合物的純度檢測過程中，顯示出極大的優(yōu)越性；與熒光檢測器相比，其樣品檢測范圍也不僅局限于熒光物質(zhì)；與示差檢測器相比，它避免了對工作環(huán)境、流速、溫度的苛刻要求和無法進行梯度洗脫的局限性；與質(zhì)譜檢測器和核磁共振檢測器相比，又具有較大的價格優(yōu)勢。本文綜述了近年來蒸發(fā)光散射檢測器在中藥分析中具有代表性的應(yīng)用。

1ELSD的工作原理

ELSD利用流動相與被檢測物質(zhì)之間蒸氣壓的相對差異，在流動相揮發(fā)除去的基礎(chǔ)上，不揮發(fā)性的組分粒子可以使從激光光源中發(fā)出的光受到散射，散射光信號被硅光二極管記錄并通過信號輸出。

ELSD的基本構(gòu)造由霧化器、加熱漂移管和光散射池組成，檢測主要分為3個步驟：①用惰性氣體(如N2、He等)霧化色譜柱洗脫液；②流動相在加熱的漂移管中蒸發(fā)；③樣品顆粒散射光以后得到檢測。即霧化-蒸發(fā)-檢測3個步驟。

2ELSD的優(yōu)點

蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)最大的優(yōu)勢在于能檢測不含發(fā)色團的化合物，響應(yīng)不依賴于樣品的光學(xué)特性，任何揮發(fā)性低于流動相的樣品均能被檢測，低溫下也能使用。ELSD常與HPLC聯(lián)用，用于化合物的分析檢測。而且，ELSD與HPLC-MS的色譜要求一致，二者可通用。

3ELSD的應(yīng)用

3.1　在中藥特定化學(xué)成分群分析中的應(yīng)用

中藥的化學(xué)成分復(fù)雜，有一部分成分無紫外吸收或僅在紫外末端有吸收，加上色譜分離的困難以及流動相帶來的干擾，使用傳統(tǒng)的紫外檢測器對其進行定性定量分析十分困難。ELSD在一定程度上彌補了這些不足，在紫外檢測器的弱勢檢測區(qū)如皂苷類、糖類、萜類與部分生物堿類成分以及其他一些成分的分析過程中，發(fā)揮了重要的作用，為中藥化學(xué)成分分析提供了支持。

3.1.1糖類成分的分析糖類成分大多不存在紫外吸收，以前主要采用分光光度法對這類成分進行定量分析，但只能測定總糖含量，靈敏度和準(zhǔn)確度較差。近年來，國內(nèi)有不少HPLC-ELSD法測定中藥材及其提取物中單糖的報道。嵇文亞等[1]使用Zorbax RX-SIL柱，以乙腈-水作為流動相梯度洗脫，采用HPLC-ELSD法同時測定熟地黃中果糖、葡萄糖含量，取得了較好的分離度。王志斌等[2]采用HPLC-ELSD法測定了麥冬藥材及其提取物中果糖的含量，色譜條件是Inertail-NH2柱，乙腈-水(78:22)為流動相。趙奎君等[3]采用Alltech Pevail Carbohydrate ES色譜柱，乙腈-水(80:20)為流動相，采用HPLC-ELSD方法，對20批肉蓯蓉和管花肉蓯蓉中半乳糖醇進行分析，平均回收率(n=5)分別為100.34%和101.11%，RSD分別為1.72%和1.33%。

3.1.2皂苷類成分的分析皂苷類成分大多無紫外吸收，或僅在紫外末端有吸收，使用紫外檢測法進行檢測時容易受到試劑的干擾。應(yīng)用HPLC-ELSD可以避免紫外檢測器的不足，較好地檢測皂苷成分。ELSD應(yīng)用于皂苷類成分分析的例子比較多。張軍武等[4]采用HPLC-ELSD法測定不同生長年限黃芪中黃芪甲苷的含量，色譜柱為Hypersil C18柱，流動相為乙腈-水(32:68)，方法學(xué)考察結(jié)果良好。Sun等[5]采用HPLC-ELSD法同時對人參中人參皂苷進行定量，結(jié)果19種人參皂苷分離效果良好。Huang等[6]采用HPLC-ELSD法同時對柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、6″-乙酰柴胡皂苷a、3″-乙酰柴胡皂苷d、6″-乙酰柴胡皂苷d的含量進行了測定。使用Zorbax SB-C18柱，乙腈-水作為流動相梯度洗脫。ELSD參數(shù)為：漂移管溫度40℃，氮氣流速3.5 L/min。分析時間短，分離效果良好。

3.1.3生物堿類成分的分析由于貝母類生物堿在結(jié)構(gòu)上無共軛雙鍵，很難用HPLC-UV法直接測定；用柱前衍生化的HPLC-UV法和氣相色譜(GC)分析方法測定貝母生物堿的含量也存在一定的問題，而HPLC-ELSD可以很好地測定貝母藥材中的主要生物堿。薛燕等[7]利用HPLC-ELSD法定量測定了幾十種不同產(chǎn)地來源的浙貝母中的貝母素甲和貝母素乙的含量，使用XTerra RP18色譜柱，乙腈-碳酸氫銨(pH=10.10)梯度洗脫。ELSD參數(shù)：漂移管溫度85℃，氮氣壓力0.2 MPa，增益50。結(jié)果表明，浙貝母中的貝母素甲及乙能夠獲得很好的分離，且分離度及重現(xiàn)性較好。黃林芳等[8]利用HPLC-ELSD法測定了川貝母中3種生物堿貝母辛、貝母甲素和貝母乙素的含量，色譜條件為Waters XTerra?MS C18柱，以乙腈-水-碳酸氫銨(pH=10.10)流動相。錢敏等[9]采用HPLC-ELSD法對太白貝母中幾種主要生物堿的測定，也為貝母的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供了依據(jù)。

3.1.4內(nèi)酯類成分的分析中藥中萜類化合物以二萜和倍半萜常見，有的以內(nèi)酯形式存在，其紫外吸收一般都在較低波長范圍內(nèi)，如銀杏酮酯中萜類內(nèi)酯無C=C雙鍵和共軛結(jié)構(gòu)，無法采用紫外檢測器進行檢測，使用ELSD作為檢測手段可以取得較好的效果。王海濤等[10]采用該方法測定舒血寧注射液配伍溶液中銀杏內(nèi)酯含量，使用Phenomenex C18柱，流動相為甲醇-四氫呋喃-水(20:10:75)，為保證舒血寧注射液的臨床療效和保障臨床用藥的安全提供了有力的技術(shù)支持。白娟等[11]采用HPLC-ELSD法，測定銀杏酮酯軟膠囊中銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯的含量，色譜條件為Diamonsil C18柱，正丙醇-四氫呋喃-水(1:25:74)為流動相，ELSD漂移管溫度40 ℃，氮氣流速3.5 L/min，分離良好且陰性對照溶液無干擾。

3.2　在多成分群中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用

目前，有相當(dāng)大的一部分中藥，其中所含的主要成分、活性成分或者質(zhì)量控制的目標(biāo)成分均沒有紫外吸收或僅在紫外末端有吸收，給質(zhì)量控制工作帶來了一定的困難。采用HPLC-ELSD方法，針對于那些沒有紫外吸收或末端吸收的目標(biāo)成分，可以對中成藥、中藥飲片及配方顆粒建立科學(xué)準(zhǔn)確的質(zhì)量控制方法。方惠娟等[12]采用HPLC-DAD-ELSD串聯(lián)技術(shù)，同時測定蒺藜中黃酮苷元和皂苷元成分的含量，為蒺藜的全面質(zhì)量控制提供了一定的科學(xué)依據(jù)。近來有許多采用HPLC-ELSD方法對中藥復(fù)方進行質(zhì)量控制的報道，如在血府逐瘀膠囊的研究中，采用HPLC-ELSD法同時測定苦杏仁苷、芍藥苷、柚皮苷的含量，3個成分均能達到基線分離，平均回收率分別為苦杏仁苷97.47%，RSD為2.1%(n=6) ；芍藥苷99.19%，RSD為1.9%(n=6)；柚皮苷 98.38%，RSD為1.3%(n=6)。該方法簡便、可靠、重現(xiàn)性好，可作為血府逐瘀膠囊的質(zhì)量控制方法[13]。三七消散丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[14]、通竅鼻炎顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[15]等采用HPLC-ELSD法來定量，，也都取得了良好的結(jié)果。

3.3　在中藥指紋圖譜中的應(yīng)用

中藥指紋圖譜的研究是目前較多使用HPLC-UV/DAD系統(tǒng)的領(lǐng)域，它可以比較全面地反映中藥所含內(nèi)在化學(xué)成分的種類和數(shù)量，但是不能使弱紫外吸收成分和無紫外吸收成分在指紋圖譜中有所體現(xiàn)。ELSD是通用型檢測器，如果選擇適當(dāng)?shù)纳V條件和儀器參數(shù)，在確保其穩(wěn)定性和精密度的前提下，應(yīng)用于中藥指紋圖譜的建立，可以全面地控制中藥中的整體物質(zhì)群，更符合中藥指紋圖譜的要求。采用HPLC-ELSD指紋圖譜研究比較成功的有河北道地藥材知母的指紋圖譜研究，首次采用HPLC-ELSD法建立了河北道地藥材中知母皂苷類成分的指紋圖譜，并對不同產(chǎn)地的知母進行了相似度比較，為建立符合規(guī)模化生產(chǎn)的知母藥材基地提供更多的科學(xué)數(shù)據(jù)，為知母藥材及其提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供了科學(xué)依據(jù)[16]。曹進等[17]運用HPLC-ELSD建立了復(fù)方清開靈注射液的指紋圖譜，對其中7種有效成分進行了定量測定，方法學(xué)考察結(jié)果良好；通過指紋圖譜相似度評價軟件，對10批清開靈注射液的HPLC-ELSD指紋圖譜進行了相似度計算，結(jié)果表明，10批樣品相似度良好。該方法為中藥質(zhì)量控制提供了一種可以同時實現(xiàn)整體定性、指標(biāo)成分定量且簡便易行的模式。

3.4　在多譜聯(lián)用技術(shù)中的應(yīng)用

ELSD和質(zhì)譜、波譜或其他色譜進行聯(lián)用，可以起到互為補充的作用。ELSD可以作為流速暫停液相色譜-核磁分析系統(tǒng)(LC-NMR)在線檢測器，在NMR記錄化合物波譜數(shù)據(jù)的同時，記錄下化合物保留時間、純度狀況等色譜數(shù)據(jù)[18]。此外，ELSD可以方便的和UV/DAD串聯(lián)，同時記錄數(shù)據(jù)信號，可以保證在每一次的分析中得到的信息更全面。嚴詩楷等[19]采用所建立的HPLC-DAD-ELSD方法，同時定量測定了清開靈注射液中5類不同結(jié)構(gòu)類型的9種化合物，方法簡便易行，分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為中藥復(fù)雜體系的多組分同時定量測定及其質(zhì)量控制提供了一條新的思路。成洪達等[20]在對六味地黃丸的研究中，將紫外檢測器的高靈敏性和蒸發(fā)光散射檢測器的通用性結(jié)合起來，結(jié)果顯示，紫外檢測器共檢測到156個峰，蒸發(fā)光散射檢測器檢測到195個峰，其中41個色譜峰為共有峰，對樣品進行了更全面的分析，適宜于對中藥的指紋圖譜研究和質(zhì)量控制。

3.5　在高通量篩選中的應(yīng)用

由于結(jié)構(gòu)的多樣性，很多定量天然產(chǎn)物的方法受到限制。Dalisay等[21]通過整合以重氫為溶劑的13C-NMR特征峰來量化天然產(chǎn)物的摩爾量。雖然NMR方法準(zhǔn)確適用，但是樣品制備和分析時間使其用于大量的天然產(chǎn)物受到限制。ELSD代替了NMR，它的使用在量化組合庫上取得了巨大的成功。在天然產(chǎn)物的研究中，當(dāng)化合物缺乏生色團時，ELSD是液相色譜定量的首選檢測器。Johnson等[22]構(gòu)建了以LC-MS-UV-ELSD為基礎(chǔ)建立天然產(chǎn)物庫的方法，適合高通量篩選，且用ELSD檢測到一種新的缺乏生色團的化合物-aignopsanoic acid B。此外，Camp等[23]最近采用RP HPLC-UV-ELSD，研究一個兩步分餾法生成類似藥物理化性質(zhì)的天然產(chǎn)物庫。隨后，高通量篩選了202 983個化合物，產(chǎn)生了60個對抗瘧疾和58個對抗錐蟲病的活性化合物。自動化程度的提高，增加產(chǎn)生大量的天然產(chǎn)物庫的可行性。采用低濕蒸發(fā)光散射檢測器 (low-temperature evaporative light scattering detectors，ELSD-LT)定量天然產(chǎn)物，通過建立平均校準(zhǔn)曲線對天然產(chǎn)物的“通用”量化進行評估[24]。ELSD-LT硬件和參數(shù)的優(yōu)化提高了靈敏度和通量，并將ELSD-LT用于大型天然產(chǎn)物庫的量化。作為一種通用型檢測器，ELSD在高通量藥物篩選研究領(lǐng)域中發(fā)揮了重要的作用。

4結(jié)語

ELSD最大的局限性是它的流動相必須能夠全部蒸發(fā)，以避免不揮發(fā)物沉積在加熱室及光學(xué)檢測池體中。因此，只能使用揮發(fā)性化合物來調(diào)節(jié)流動相的pH，例如氨、乙酸和三氟乙酸等。ELSD的靈敏度還不是很理想，如果采用微徑色譜柱，將會大大提高其靈敏度。另外，ELSD的數(shù)據(jù)處理問題尚需做進一步的深入探討。雖然ELSD還有一些不足的地方，不可能完全代替UV檢測器，但是對于一些弱紫外吸收或無紫外吸收成分的分析，ELSD在定量分析中發(fā)揮了重要作用；在定性鑒別的研究中，ELSD也可以比較全面地反映樣品的信息。隨著檢測技術(shù)和儀器本身的不斷完善，相信ELSD會起到越來越重要的作用。

【參考文獻】

[1]嵇文亞，周利艷，孟江.HPLC-ELSD法同時測定熟地黃中果糖、葡萄糖含量[J].齊魯藥事，2007，26(6)：338-340.

[2]王志斌，陳有根，李慧.HPLC-ELSD法測定麥冬藥材及其提取物中果糖的含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14 (2)：47-48.

[3]趙奎君，梁麗娟，畢丹，等.HPLC-ELSD測定肉蓯蓉及管花肉蓯蓉中半乳糖醇含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，8 (19)：52-54.

[4]張軍武，趙琦，王昌利.不同生長年限黃芪中黃芪甲苷的含量測定[J].西部中醫(yī)藥，2012，3(25)：30-31.

[5]Sun BS，Gu LJ，F(xiàn)ang ZM，etal.Simultaneous quantification of 19 ginsenosides in black ginseng developed from Panax ginseng by HPLC-ELSD[J].J Pharm Biomed Anal，2009，50(1):15-22.

[6]Huang HQ，Zhang Xi，Xu ZX，etal.Fast determination of saikosaponins in Bupleurum by rapid resolution liquid chromatography with evaporative light scattering detection[J].J Pharm Biomed Anal，2009，49(4):1048-1055.

[7]薛燕，顧好糧.HPLC-ELSD法測定浙貝母中主要生物堿的含量[J].藥學(xué)學(xué)報，2005，40(6)：550-552.

[8]黃林芳，陳士林，劉輝，等.HPLC-ELSD測定不同加工方法川貝母中3種生物堿[J].中成藥，2009，10(31)：1560-1564.

[9]錢敏，彭銳，馬鵬.太白貝母中幾種主要生物堿的HPLC-ELSD測定[J].重慶中草藥研究，2011，12(2)：24-30.

[10]王海濤，馮志瓊，蔡海燕，等.HPLC-ELSD法測定舒血寧注射液配伍溶液中內(nèi)酯含量[J].世界中醫(yī)藥，2011，11(6)：530-531.

[11]白娟，張潔，李成網(wǎng).HPLC-ELSD法測定銀杏酮酯軟膠囊中萜類內(nèi)酯的含量[J].化學(xué)分析計量，2012，1(21)：64-66.

[12]方惠娟，畢開順，錢忠直，等.HPLC-DAD-ELSD測定蒺藜中5個活性成分含量[J].藥物分析雜志，2012，32(6)：966-969.

[13]高穎，高文遠，董玄，等.HPLC-ELSD法測定血府逐瘀膠囊中苦杏仁苷、芍藥苷和柚皮苷[J].中草藥，2009，11(40)：1756-1758.

[14]李素梅，江志強，孫冬梅.三七消散丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中醫(yī)研究，2010，7(23)：17-20.

[15]桑育黎，郝延軍.通竅鼻炎顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18(17)：83-85.

[16]張志斐，肖蓉，袁志芳，等.河北道地藥材知母HPLC-ELSD指紋圖譜研究[J].藥物分析雜志，2006，26(11)：1569-1573.

[17]曹進，徐燕，張永知，等.清開靈注射液HPLC-ELSD指紋圖譜建立及質(zhì)量相關(guān)性研究[J].分析化學(xué)，2004，32(4)：469-473.

[18]Petfitis K，Gellaizeau I，Elfakir C，etal.Evaporative light scattering detection for in-line monitoring of stopped-flow liquid chromatography-nuclear magnetic resonance analysis of compounds with weak or no chromophore groups[J].J Sep Sci，2002，25(9)：593-600.

[19]嚴詩楷，辛文峰，羅國安，等.應(yīng)用高效液相色譜-二極管陣列檢測器-蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用技術(shù)同時測定清開靈注射液中的五類有效成分[J].色譜，2005，5(23)：482-486.

[20]成洪達，邢占芬，李彤，等.雙檢測器串聯(lián)色譜柱分析六昧地黃丸[J].四川大學(xué)學(xué)報，2011，1(48)：159-162.

[21]Dalisay DS，Molinski TF.NMR quantitation of natural products at the nanomole scale[J].J Nat Prod，2009，72(4)：739-744.

[22]Johnson TA，Sohn J，Inman WD，etal.Natural product libraries to accelerate the high-throughput discovery of therapeutic leads[J].J Nat Prod，2011，74(12)：2545-2555.

[23]Camp D，Davis RA，Campitelli M，etal.Drug-like properties：guiding principles for the design of natural product librariess[J].J Nat Prod，2012，75(1)：72-81.

[24]Adnani N，Michel CR，Bugni TS.Universal quantification of structurally diverse natural products using an evaporative light scattering detector[J].J Nat Prod，2012，75(4)：802-806.

[本文編輯]陳靜