中藥單體誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化研究進(jìn)展

陳洪超(綜述)，曾維政(審校)

(成都軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科，成都 610083)

中藥單體誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化研究進(jìn)展

陳洪超(綜述)，曾維政※(審校)

(成都軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科，成都 610083)

摘要：間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有自我更新和多向分化能力，應(yīng)用前景廣闊。利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)MSCs定向分化是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的關(guān)鍵。中藥單體成分多樣，結(jié)構(gòu)明確，活性廣泛。應(yīng)用中藥單體誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化成為中藥研究的新熱點。該文對近年來中藥單體誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝樣細(xì)胞的定向分化研究進(jìn)行綜述，為中藥深入開發(fā)提供新思路。

關(guān)鍵詞：中藥單體；間充質(zhì)干細(xì)胞；定向分化

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是來源于發(fā)育早期中胚層的一類具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞[1]。MSCs具有多向分化的潛能，不僅能分化成中胚層起源的多種組織細(xì)胞(如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等)，而且在適宜條件下跨組織分化為肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肺、小腸細(xì)胞等，并具有相應(yīng)的功能[2-4]。MSCs對損傷的組織和器官具有修復(fù)作用，對其研究開發(fā)成為組織工程、細(xì)胞工程、細(xì)胞治療及基因治療等領(lǐng)域的研究熱點。傳統(tǒng)中藥取材方便，使用安全，在治療人類疾病和保障健康方面具有不可替代的作用。中藥單體復(fù)雜多樣，活性廣泛。近年來，利用中藥單體定向誘導(dǎo)MSCs的研究成為中藥研究的新熱點，許多研究者對中藥單體定向誘導(dǎo)MSCs進(jìn)行了探索性研究?，F(xiàn)對中藥單體誘導(dǎo)MSCS定向分化研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1中藥單體誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化

各種原因引起的骨缺損后期修復(fù)是骨科領(lǐng)域的難題之一，但長期以來中醫(yī)藥治療骨折愈合療效顯著，具有較高的安全性。聯(lián)合中藥和MSCs，利用中藥單體誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞定向分化對此難題的解決具有積極意義。體外培養(yǎng)MSCs使其向成骨細(xì)胞分化，主要依賴于一定的培養(yǎng)條件，因此控制好培養(yǎng)條件是體外誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的關(guān)鍵。誘導(dǎo)MSCs成骨分化的中藥單體篩選多來源于抗骨質(zhì)疏松中藥。

1.1中藥淫羊藿單體成分翟遠(yuǎn)坤等[5]研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿次苷Ⅱ可通過提高誘導(dǎo)性一氧化氮合酶活性，促進(jìn)一氧化氮生成，激活NO信號通路，促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化。楊麗等[6]研究提示，上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的表達(dá)量可能是淫羊藿苷誘導(dǎo)促進(jìn)MSCs骨向分化的作用機(jī)制之一。張錦芳等[7]研究表明，Wnt信號通路抑制劑DKK-1能部分抑制淫羊藿黃酮誘導(dǎo)MSCs的成骨效果，說明Wnt信號通路參與了其誘導(dǎo)成骨分化的過程。

1.2中藥蛇床子單體成分明磊國等[8]研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素能提高M(jìn)SCs的堿性磷酸酶活性，促進(jìn)骨鈣素分泌、鈣鹽沉積量，增加鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量，提高堿性成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子1、成骨細(xì)胞鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2的mRNA表達(dá)水平，明顯促進(jìn)其向成骨性分化，證明蛇床子素是中藥蛇床子抗骨質(zhì)疏松的有效成分。蛇床子素濃度高于10-4mol/L時對細(xì)胞有強(qiáng)烈抑制甚至有毒害作用，其中1×10-5mol/L組促進(jìn)MSCs的成骨性分化能力最強(qiáng)[8]。

1.3其他抗骨質(zhì)疏松中藥單體成分尚希福等[9]用茶黃素、楊淵等[10]用柚皮苷、武密山等[11]用川續(xù)斷皂苷Ⅵ體外均成功誘導(dǎo) MSCs定向分化為成骨細(xì)胞，川續(xù)斷皂苷Ⅵ促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞增殖和分化的作用可能與其升高核心結(jié)合因子亞單位1 mRNA的表達(dá)有關(guān)。

2中藥單體誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化

近幾年，國內(nèi)在用中藥單體誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞方面進(jìn)行了嘗試?？寡趸饔每赡苁侵兴巻误w產(chǎn)生定向誘導(dǎo)的主要原因之一，作為鈣離子拮抗劑或鈣離子通道阻斷劑保護(hù)神經(jīng)元也是一些中藥單體起效的影響因素。

2.1具有抗氧化作用的丹參單體成分余勤等[12]用丹參素誘導(dǎo)骨髓MSCs，其中堿性成纖維細(xì)胞生長因子可能參與了MSCs向神經(jīng)元分化的啟動，而丹參素在其后向神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化及擴(kuò)增中起重要作用。夏文杰等[13-14]用丹參酮ⅡA、隱丹參酮均成功誘導(dǎo)MSCs在體外分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。丹參有效成分丹參素、丹參酮ⅡA、隱丹參酮，均具有抗氧化作用，其作用機(jī)制可能是抑制環(huán)核甘酸磷酸二酯酶的活力，提高胞內(nèi)cAMP環(huán)核苷酸水平，后者進(jìn)一步激活cAMP依賴蛋白激酶、p38、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1和2等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終引起神經(jīng)突起發(fā)生和延長。

2.2具有鈣離子拮抗劑作用的單體成分川芎嗪是從川芎中提取的一種生物堿單體，是一種新型的鈣離子拮抗劑，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜作用，可保護(hù)視神經(jīng)，促進(jìn)骨髓移植后造血重建等作用。劉云云等[15]研究表明，川芎嗪具有體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的作用。人參皂苷RgⅠ具有鈣離子拮抗作用，對神經(jīng)元有保護(hù)作用。鄔偉等[16]研究表明，人參皂苷RgⅠ可以在體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并且可能表達(dá)神經(jīng)生長因子mRNA。

2.3其他具有神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)作用的單體成分汪泱等[17]用阿魏酸鈉、黃家貴等[18]用白藜蘆醇、項平和李海標(biāo)[19]用黃連素、潘國強(qiáng)等[20]用金雀異黃素體外分別誘導(dǎo)MSCs成功向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。顏曉華和黃瑞濱[21]用黃芩苷在體外成功誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞，低濃度的黃芩苷體外擴(kuò)增在一定程度上起到了預(yù)誘導(dǎo)分化作用，黃芩苷誘導(dǎo)作用溫和、穩(wěn)定而持久，誘導(dǎo)出的神經(jīng)元樣細(xì)胞成活時間長，其誘導(dǎo)機(jī)制可能與黃芩苷的抗氧化、調(diào)控細(xì)胞核因子κB的活性從而刺激多種細(xì)胞因子的表達(dá)和生成有關(guān)。蘇平等[22]研究顯示，銀杏內(nèi)酯B誘導(dǎo)的MSCs不僅具有神經(jīng)細(xì)胞的外形和免疫學(xué)特征，而且具有神經(jīng)元的基本電生理功能。

3中藥單體誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞分化

常用的心肌細(xì)胞體外誘導(dǎo)劑5-氮胞苷是抗腫瘤制劑，其心肌細(xì)胞的分化率很低，臨床安全性和長期有效性難以實現(xiàn)。而中藥具有臨床應(yīng)用安全性和長期有效性的特點，因此國內(nèi)學(xué)者對中藥單體誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細(xì)胞進(jìn)行了相關(guān)探索。季紅等[23]將MSCs分為4組：空白對照組、5-氮胞苷組、丹酚酸B組、5-氮胞苷聯(lián)合丹酚酸B組進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)4周。誘導(dǎo)分化后的各組不同程度的陽性表達(dá)心肌細(xì)胞特異性蛋白心肌肌鈣蛋白T，誘導(dǎo)組糖原合成激酶基因表達(dá)上調(diào)，β-聯(lián)蛋白基因表達(dá)下調(diào)。丹酚酸B促進(jìn)MSCs向心肌細(xì)胞分化，伴有Wnt經(jīng)典信號通路的抑制。

冼紹祥等[24]對MSCs進(jìn)行分組誘導(dǎo)：黃芪甲苷組(終濃度為250 mg/L)、5-氮胞苷組(終濃度為10 μmol/L)、黃芪甲苷加5-氮胞苷組(終濃度分別為250 mg/L、10 μmol/L)，誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)4周。誘導(dǎo)后細(xì)胞呈梭形，并出現(xiàn)肌管；各組在不同時間的心肌樣細(xì)胞誘導(dǎo)率無明顯差異；誘導(dǎo)后MSCs表達(dá)心肌特異性結(jié)蛋白、肌鈣蛋白I和成熟的心肌特異性蛋白心肌肌球蛋白重鏈、心肌肌球蛋白重鏈。但黃芪甲苷誘導(dǎo)MSCs定向分化為心肌樣細(xì)胞的誘導(dǎo)率仍有待提高。

4中藥單體誘導(dǎo)MSCs向肝樣細(xì)胞分化

肝臟疾病是嚴(yán)重危害人類健康的一類疾病，是人類疾病死亡的主要原因之一。目前，肝移植仍然是臨床上治療中晚期肝臟疾病的最后手段，但由于供肝來源困難、免疫抑制劑的終生應(yīng)用及昂貴的手術(shù)費用等諸多因素，大大限制了肝移植在臨床上的普及應(yīng)用。干細(xì)胞移植作為一種新興起的先進(jìn)療法，與肝臟移植相比，具有手術(shù)簡單、創(chuàng)傷小、費用低廉、來源相對豐富、細(xì)胞可以儲備及免疫原性弱等諸多優(yōu)點。

當(dāng)前，誘導(dǎo)MSCs向肝樣細(xì)胞分化常用誘導(dǎo)劑肝細(xì)胞生長因子是個多效應(yīng)的生長因子，其作用的多效性相應(yīng)降低了干細(xì)胞肝向分化的專一性，使誘導(dǎo)所得的肝樣細(xì)胞數(shù)量低于預(yù)期。因此，從對肝功能具有保護(hù)作用和對肝臟損傷有一定臨床治療作用的中藥中尋找誘導(dǎo)干細(xì)胞肝樣分化的有效成分，將其單獨或聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化具有重要意義。

黃偉等[25]研究顯示，在紅景天苷單獨誘導(dǎo)作用下MSCs在體外能轉(zhuǎn)化為肝樣細(xì)胞，與單用肝細(xì)胞生長因子、紅景天苷相比，兩者聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)臍血MSCs向肝樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用，其中以10 mol/L紅景天苷聯(lián)合10 μg/L肝細(xì)胞生長因子的誘導(dǎo)效果最佳。此后，杜超等[26]研究也表明，紅景天苷能誘導(dǎo)MSCs向肝樣細(xì)胞分化，紅景天苷聯(lián)合淤膽血清能更有效地誘導(dǎo)MSCs向肝樣細(xì)胞分化。而Ouyang等[27]對紅景天苷定向誘導(dǎo)MSCs向肝樣細(xì)胞分化機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)過程中加入細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1和2、p38以及磷脂酰肌醇3-激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑，3條信號通路均有參與，磷脂酰肌醇3-激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起主要作用。陳艷等[28]研究表明，20 μmol/L姜黃素能單獨誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞，與成纖維細(xì)胞生長因子4聯(lián)合應(yīng)用可使姜黃素的誘導(dǎo)濃度降低，效果更好，安全性更可靠。

5問題與展望

雖然中藥單體在體外誘導(dǎo)MSCs定向分化方面已有較多成功的實驗報道，但要將其應(yīng)用于臨床，仍有諸多問題亟待解決。已證實的在體外具有誘導(dǎo)MSCs定向分化的中藥單體誘導(dǎo)效果如何？誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是否具有相應(yīng)的生理功能？能否在體內(nèi)試驗中同樣誘導(dǎo)MSCs產(chǎn)生定向分化？目前對中藥單體誘導(dǎo)MSCs定向分化機(jī)制研究過于簡單，多為描述性研究，仍有待深入研究。

誘導(dǎo)分化機(jī)制研究方面，已有研究開始利用基因芯片技術(shù)對中藥單體誘導(dǎo)MSCs的機(jī)制進(jìn)行研究，通過基因芯片技術(shù)尋找與分化相關(guān)的信號通路，進(jìn)而利用基因和蛋白等分子生物學(xué)技術(shù)對各相關(guān)信號通路進(jìn)行驗證和研究[29]。磁性納米粒子體外標(biāo)記MSCs等技術(shù)的發(fā)展則實現(xiàn)了對干細(xì)胞移植后在體內(nèi)的分化與分布進(jìn)行實時監(jiān)控，對中藥單體誘導(dǎo)MSCs體內(nèi)分化的效果進(jìn)行評價[30]。在今后的研究中，如何建立高效的中藥誘導(dǎo)MSCs分化篩選體系是研究開發(fā)的關(guān)鍵。高通量篩選對MSCs分化具有明顯作用的中藥有效成分，進(jìn)而對MSCs誘導(dǎo)過程中細(xì)胞分化方向、信號通路及誘導(dǎo)分化機(jī)制進(jìn)行更加深入的研究。通過上述相關(guān)研究，有望從中藥中開發(fā)出促進(jìn)MSCs定向分化的有效藥物，對中藥現(xiàn)代化研究與開發(fā)具有重要意義。

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Research Advances on the Oriented Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Induced by Chinese Medicinal MonomersCHENHong-chao,ZENGWei-zheng.(DepartmentofGastroenterology,GeneralHospitalofChengduMilitaryCommand,Chengdu610083,China)

Abstract:Mesenchymal stem cells(MSCs) are a group of cells with the capability of self-renewal and potential of multilineage differentiation,which have broad application prospects.Oriented differentiation of MSCs induced by revulsant is a key point in the field of stem cell research.Chinese medicinal monomers are diverse and have widespread activity.Application research of the oriented differentiation of MSCs induced by Chinese medicinal monomers has become a new hotspot.Here reviews some progresses on osteoblasts,neurons-like cells,cardiomyogenic cells,hepatocyte-like cells differentiation of MSCs induced by some Chinese medicinal monomers in recent years,providing new ideas for further development of traditional Chinese medicine.

Key words:Chinese medicinal monomers; Mesenchymal stem cell; Oriented differentiation

收稿日期：2015-01-04修回日期：2015-04-20編輯：伊姍

基金項目：成都軍區(qū)總醫(yī)院院管重點課題(2013YG-A008)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.016

中圖分類號：R691

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)22-4075-03