白血病融合基因及檢測方法研究進展

肖　恒(綜述)，李守霞(審校)

(邯鄲市中心醫(yī)院檢驗科，河北 邯鄲 056001)

白血病融合基因及檢測方法研究進展

肖恒(綜述)，李守霞※(審校)

(邯鄲市中心醫(yī)院檢驗科，河北 邯鄲 056001)

摘要：白血病是一種造血干細胞異常克隆增殖性疾病，臨床表現(xiàn)主要為骨髓和外周血中白血病細胞大量增殖且分化障礙，其發(fā)病與融合基因的形成相關。目前發(fā)現(xiàn)的融合基因主要有BCR-ABL、PML-RARA、AML1-ETO、CBFβ-MYH11、TEL/AML1、E2A/PBX1、MLL重排形成的基因、DEK-CAN等，對白血病的診斷和治療有重要意義。而檢測融合基因的方法主要包括熒光原位雜交、免疫印跡、聚合酶鏈反應、流式細胞術、基因芯片及全基因組測序等方法。

關鍵詞：白血?。蝗诤匣?；檢測方法

白血病是一類起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病[1]，其克隆的白血病細胞增殖失控，分化障礙，凋亡受阻，并在骨髓和其他造血組織中呈惡性增生，使正常造血受抑制，且可浸潤其他組織和器官。近年來，隨著白血病融合基因的發(fā)現(xiàn)及細胞遺傳學與分子生物學技術的發(fā)展，白血病融合基因和細胞與分子遺傳學技術在白血病診斷中逐漸占據(jù)重要地位。現(xiàn)就融合基因的表達在白血病診斷中的重要意義及其主要檢測方法進行綜述。

1白血病融合基因

從在慢性粒細胞白血病中發(fā)現(xiàn)BCR-ABL融合基因以來，越來越多的融合基因不斷被發(fā)現(xiàn)，它們均由染色體重排形成，并成為白血病特異性的分子標志，對認識染色體重排在白血病形成中的作用研究提供了很大的幫助[2]，可用于白血病的分子生物學分型、預后觀察及微小殘留病(minimal residual disease，MRD)的診斷，目前常見于臨床的白血病融合基因主要有以下幾種。

1.1BCR-ABL融合基因最早在慢性粒細胞白血病細胞Ph染色體中發(fā)現(xiàn)，它由9q34上的原癌基因ABL與22q11上的BCR基因融合形成，即t(9；22)(q34；q11)。其編碼生成的BCR-ABL融合蛋白具有高酪氨酸激酶活性，它可通過激活下游多條信號通路而導致細胞惡性轉化，并進一步演變?yōu)榘籽　８鶕?jù)BCR斷裂點位置的不同，其編碼的蛋白分為p210、p230和p190融合蛋白。據(jù)報道，約95%以上的慢性粒細胞白血病患者和20%的急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)患者的白血病細胞中可表達BCR-ABL基因，因此BCR-ABL融合基因可用作慢性粒細胞白血病等白血病的分子診斷標志物[3]。

1.2PML-RARA融合基因它通過t(15；17)(q22；q22)染色體易位后形成。RARA基因僅有1個斷裂點，位于2號內含子，而PML基因有3個斷裂點，根據(jù)斷裂點位置的不同，分別形成長型(55%)、異構體(5%)和短型(40%)3個亞型。PML-RARA的表達可干擾RARA在核內的分布和對細胞分化的調控，使大量細胞阻滯在早幼細胞階段，從而導致急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的產(chǎn)生，可見于95%的APL患者，是APL的特異性分子標志[4-5]。其不同的基因異構體分型的預后有明顯不同，短型患者緩解前的病死率及緩解后的復發(fā)率均高于長型。此外，APL初診組和復發(fā)組的融合蛋白水平常較緩解組高，即PML/RARA融合基因可用于APL的療效觀察、預后判斷及監(jiān)測復發(fā)。

1.3AML1-ETO融合基因也被稱為RUNX1-RUNX1T1，由t(8；21)(q22；q22)易位形成[6]。AML1-ETO融合基因主要發(fā)生于M2型白血病，t(8；21)(q22；q22)陽性的AML患者中40%～50%為M2型，可作為M2b診斷的重要分子標志，其他AML可見于M1、M4、M5。由其表達生成的AML1-ETO融合蛋白是一種轉錄抑制因子，可抑制正常AML1蛋白介導的功能，改變造血祖細胞自我更新及成熟過程，同時也產(chǎn)生啟動異常造血細胞增殖的信號，引起白血病細胞生長。當其陽性時提示預后良好，完全緩解率高達90%，5年存活率達50%～70%。

1.4CBFβ-MYH11融合基因inv(16)(p13；q22)或t(16；16)(p13；q22)，可形成10余種CBFβ-MYH11融合基因轉錄本，但最常見的A亞型約占80%，D亞型占5%、E亞型占5%。它可干擾核結合因子CBF發(fā)揮作用，從而抑制造血分化和誘使細胞向白血病細胞轉化。但有敲入小鼠模型證明，CBFβ-MHY11本身并不足以導致白血病表型，可能還需要其他畸變同時存在時才能發(fā)揮作用[7]。據(jù)報道，約85.7%的M4EO患者CBFβ-MYH11融合基因表達陽性，且陽性提示預后良好。

1.5TEL/AML1融合基因為t(12；21)(p13；q22)易位[8]，它可使AML1編碼的CBRa失去與DNA結合能力或不能正常轉錄而發(fā)揮激活靶基因的作用,即AML1從轉錄激活因子轉變成轉錄抑制因子，同時它表達生成的TEL/AML1融合蛋白還可與野生型AML1競爭結合DNA結合位點，抑制其正常的轉錄活性，使AML1調節(jié)靶基因表達受抑，影響造血干細胞的自我更新和分化能力，是兒童前B-ALL時最常見的染色體異常之一，當其陽性表達時常提示預后較好。

1.6E2A/PBX1融合基因t(1；19)(q13；p22)易位[9]，約見于5%的ALL患者中，在B細胞系ALL中占20%～30%，ALL患者初治期和復發(fā)期的E2A/PBX1融合基因表達均高于緩解期，且陽性表達者的無病生存率降低，即E2A/PBX1融合基因可作為ALL及MRD診斷的分子標志，幫助判斷預后和指導治療。

1.7MLL重排形成的基因MLL基因位于11q23，白血病時尤其是AML時其可發(fā)生重排而形成融合基因，且種類和數(shù)目眾多，約占AML相關融合基因的3/5。如t(11；4)(q23；q21)易位形成的MLL/AF4融合基因，95%見于ALL[10]。此外，還有t(9；11)(p22；q23)形成的MLL/AF9融合基因，可見于86%的M5型AML[11]，及t(11；19)(q22；p13)形成的MLL-ENL 融合基因[12]等，幾乎全為AML，另還可見于拓撲異構酶抑制劑治療后產(chǎn)生的治療相關性AML。值得注意的是，通常情況下涉及MLL基因重排的白血病惡性程度較高，對常規(guī)化療不敏感，緩解率低，生存期短，是預后不良的標志。

1.8DEK-CANt(6;9)(p23；q34)，是造血系統(tǒng)罕見的隨機染色體異常，可在1%的AML中發(fā)現(xiàn)。t(6；9)陽性的AML常預后不良，有報道顯示DEK-CAN融合蛋白并不能抑制造血祖細胞的分化，因此其致病機制尚不清楚，還有待進一步的研究[13]。

1.9其他融合基因除上述幾種融合基因外，近年來尚有許多新的融合基因型不斷被發(fā)現(xiàn)，如AML1/MTG8、SET-CAN、TEL-PDGFR、TLS-ERG、AML1-MDS1(EVI-1)等[14]，它們均將成為白血病診斷、預后及MRD診斷的重要分子生物學標志。此外，一些正常核型急性髓性白血病發(fā)生的功能性基因突變，如flt3-itd/tkd[15]、C-kit[16]、mll-ptd[17]、npm1[18]等分子特征的發(fā)現(xiàn)，也為患者個體化治療提供了豐富的分子靶點。

2主要檢測技術

最初，白血病在分子遺傳學領域的主要檢測方法為染色體顯帶技術，它可檢測出染色體數(shù)目和結構異常的改變，如缺失、重復、插入、倒位和易位等，但其操作復雜且耗時，過程涉及的細節(jié)較多，對技術人員要求較高[19]。此外，它對監(jiān)測白血病患者的MRD方面效果也較差，這些都限制了其在白血病檢測中的應用。

隨著人們逐漸認識到MRD檢測在白血病復發(fā)和對白血病指導治療中的重要性，迫切需要能夠高特異性和高靈敏度檢測融合基因的方法[20]。近年來，研究人員們分別利用熒光原位雜交、免疫印跡、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)、流式細胞術(flow cytometric，F(xiàn)CM)、基因芯片及全基因組測序等方法對白血病融合基因進行了研究?，F(xiàn)將這些主要檢測方法介紹如下。

2.1熒光原位雜交熒光原位雜交是一種通過標記了熒光素的DNA按照堿基互補原則與待檢DNA進行雜交后，利用出現(xiàn)的熒光信號的數(shù)量和位置來反映標本中存在的相應特異性基因的數(shù)量和位置的方法，利用該技術對白血病預后相關基因的檢測結果已作為白血病危險度分層的參考指標[21]。它對處于分裂期和分裂間期的細胞均可以進行檢測，具有形象直觀、靈敏度高、特異性強、無放射性、可進行多重染色等優(yōu)點，且適用于血液、骨髓、組織等多種臨床標本的檢測。但由于該方法實驗步驟繁雜，過程中影響因素(溶液pH值、溫度時間等)較多，使熒光原位雜交在臨床的應用有一定局限性。

2.2免疫印跡該法是應用最廣泛的實驗室技術之一，它首先利用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質樣品進行分離，再將其轉移至固相載體(如硝酸纖維素薄膜)上，以目的蛋白或多肽作為抗原，與相應抗體即第一抗體發(fā)生抗原抗體反應，然后再與酶標記的第二抗體進行免疫反應，經(jīng)過底物顯色來檢測目的基因表達的蛋白成分。如國內白穎等[22]利用該法分別檢測了AML患者和正常人骨髓中DICER1融合基因的表達，發(fā)現(xiàn)DICER1基因在AML中的表達水平明顯高于正常對照組，其高表達可能是AML的不良預后因素。但該法實驗環(huán)境條件要求高，現(xiàn)仍主要用于科研活動中，在臨床中應用較少。

2.3PCRPCR技術是一種特異耐熱酶(Taq DNA聚合酶)催化下完成的鏈式反應，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸3個步驟反復的循環(huán)構成。其基本原理是用寡聚核苷酸引物結合在模板DNA(或靶DNA)分子上進行特異核苷酸序列擴增。PCR是檢測白血病相關融合基因較為有效且敏感的方法，已應用于白血病相關融合基因的PCR方法主要包括以下幾種。

2.3.1逆轉錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)它先以標本中提取得到的信使RNA為模板逆轉錄出互補DNA，再以互補DNA為模板通過PCR進行擴增，是在RNA水平上檢測融合基因的方法。丁凱等[23]應用RT-PCR方法檢測了急性白血病患者和健康者骨髓中PRAME基因的信使RNA表達水平，并與患者臨床資料行相關性分析后發(fā)現(xiàn)PRAME基因在急性白血病中表達率較高，可用于MRD的監(jiān)測。但由于RT-PCR是一種定性實驗，不能對融合基因進行定量，目前已經(jīng)被下述幾種PCR方法取代。

2.3.2實時定量熒光PCR(realtime quantity PCR,RQ-PCR)該方法是在PCR反應體系中加入熒光物質，通過實時檢測熒光信號在PCR過程中的累積變化，利用已知濃度的標準品制作的標準曲線對未知濃度的樣品進行定量分析的方法，它可以直接檢測目的基因的起始數(shù)量，從而動態(tài)監(jiān)測融合基因水平。該方法具有快速簡便、靈敏度高、重復性好、可準確定量等優(yōu)點，技術已較為成熟，被廣泛應用于臨床檢測。黃賽等[24]使用RQ-PCR方法對433例初治AML患者中11例MLL-AF9融合基因陽性患者的表達水平進行了檢測分析，結果顯示，RQ-PCR檢測MLL-AF9融合基因可以反映患者MRD的動態(tài)變化，與患者的臨床預后存在內在相關性，是檢測預后的良好指標，同時RQ-PCR可能有早期檢測分子生物學復發(fā)的潛力。RQ-PCR法可檢出1×106個有核細胞中的一個白血病細胞，比傳統(tǒng)的細胞學方法及臨床癥狀出現(xiàn)早5～8個月，是現(xiàn)在臨床上應用最廣、最多的方法。

2.3.3多重逆轉錄PCR(multiplex reverse transcription PCR，M-RT-PCR)該法又稱復合PCR或多重引物PCR，它的反應原理和操作過程跟普通PCR相同，不同點在于它是在同一PCR反應體系里加上兩對或多對引物，分別擴增不同的目的片段，從而同時獲得多個核酸片段。該法在保留了普通PCR方法的高敏感性和高特異性的基礎上，極大地縮短了實驗時間，提高了檢測效率。姜孟孟等[25]應用多重巢式RT-PCR方法檢測了168例初治AML患者的骨髓標本AML融合基因，結果表明有18例出現(xiàn)AML1融合基因，其中AML1-ETO、AML1-EV11、AML1-MDS1、AML1-MTG16、AML1-PRDM16、AML1-CLCA2陽性率依次為7.14%、1.19%、0.6%、0.6%、0.6%、0.6%。該法經(jīng)濟實用，檢測快速，在臨床應用率也較高。但是，由于其僅能檢測已知的基因異常，而對未知的染色體易位和數(shù)量異常等無法識別，且樣本間易存在交叉污染等使其有一定的局限性。

2.4FCMFCM是對懸液中的單細胞或其他生物粒子通過檢測標記的熒光信號，實現(xiàn)高速、逐一的細胞定量分析和分選的技術[26]。該法具有客觀、準確、重復性好、可定量的特點，能快速地對大量細胞逐個進行多參數(shù)的測定和分析，還可對細胞進行分選，目前被廣泛應用于血液學、免疫學、腫瘤學、遺傳學、細胞生物學、微生物學等方面，是目前最熱門的科學研究方法之一。

近年來該法在檢測白血病的免疫分型及白血病患者MRD等方面應用逐漸增多，它主要利用白血病細胞與正常細胞的免疫表型特征的差異，對白血病細胞及MRD進行檢測。有研究者對139例異基因造血干細胞移植后的急性淋巴細胞白血病患者，運用四色FCM評估其MRD監(jiān)測的預后價值，發(fā)現(xiàn)移植后FCM陽性的患者同F(xiàn)CM陰性患者相比，前者具有較低的無事件生存率和較高的累積復發(fā)發(fā)生率[27]。目前白血病免疫分型已成為WHO有關血液系統(tǒng)惡性疾病診斷標準的主要內容，在歐美發(fā)達國家更是作為臨床血液系統(tǒng)腫瘤診斷與療效檢測不可缺少的依據(jù)。

但該方法在實際應用時存在一定的缺陷，如一些化療后的非惡性淋巴細胞前體細胞因與白血病淋巴細胞具有相似性而容易被誤認，導致假陽性的發(fā)生，且敏感性方面也遠不如PCR技術等。

2.5基因芯片技術基因芯片技術指將大量探針分子固定于支持物表面，再與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測各個探針分子的雜交信號強度獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息的方法。該方法具有快速、簡便、分辨率高、高通量等優(yōu)點，可以通過設計不同的探針陣列一次性對樣品大量序列進行多項檢測和分析，此外還可用于突變基因的檢測和發(fā)現(xiàn)。早在1999年，Gulob等[28]已研制出用于白血病分型的基因芯片，近年來，應用基因芯片技術進行白血病的轉錄基因表達譜研究報道較多，但用于臨床診斷的基因芯片尚未問世，仍處于研究探索階段。

2.6全基因組測序全基因組測序即對一種生物的基因組中的全部基因進行測序，測定其DNA的堿基序列。全基因組測序覆蓋面廣，能檢測個體基因組中的全部遺傳信息；準確性高，其準確度可高達99.99%，多應用于科研，尚未常規(guī)應用于臨床診斷[29]。Welch等[30]為確定全基因組測序是否可以識別基因突變，對1例帶有無致病性x-RARA融合基因的APL患者進行末端配對測序方法檢測，發(fā)現(xiàn)了經(jīng)典的br3 PML-RARA融合基因，說明全基因組測序是突變檢測通用的穩(wěn)定的平臺。

3小結

白血病作為一種造血細胞克隆性疾病，細胞遺傳學改變在其發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。一方面，由于攜帶相同融合基因的患者在診斷和治療上存在一定的同質性以及預后的可比性，融合基因檢測被廣泛地應用于白血病的診斷分型及療效觀察。另一方面，監(jiān)測融合基因表達量還有助于臨床醫(yī)師進一步在分子水平上確定白血病患者治療后是否獲得完全緩解，以便及時調整治療方案，減輕患者的痛苦和經(jīng)濟負擔。此外，定期檢測MRD患者體內融合基因表達水平，可更早預測白血病的復發(fā)，指導臨床治療，根據(jù)融合基因表達水平的多少，決定是否繼續(xù)化療，有利于評價治療效果，預測復發(fā)。綜上，檢測融合基因的方法雖種類多樣，但其各有優(yōu)缺點，為了取得較好的檢測結果，常常還是需要聯(lián)合使用幾種檢測方法。相信隨著分子生物學的飛速發(fā)展和新的融合基因的不斷發(fā)現(xiàn)，白血病的診斷和分型將進入一個嶄新的階段，同時利用分子生物學方法對融合基因進行深入研究，如尋找白血病融合基因相關作用靶標、研究靶向治療藥物等，將為白血病的個性化治療提供更加有力的支持。

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Advances in Leukemia Fusion Gene and the Detection TechnologyXIAOHeng,LIShou-xia.(ClinicalLaboratoryofHandanCentralHospital,Handan056001,China)

Abstract：Leukemia is a kind of hyperplastic disease of abnormal hematopoietic stem cell cloning,and the main clinical manifestation is the proliferation and abnormal differentiation of leukemia cells in bone marrow and peripheral blood,which is associated with the formation of fusion gene.So far the discovered fusion genes mainly inlcude BCR-ABL,PML-RARA,AML1-ETO,CBFβ-MYH11,TEL/AML1,E2A/PBX1,MLL rearrangement genes and DEK-CAN,which are of great significance for the diagnosis and treatment of leukemia.Detection methods of fusion genes mainly include fluorescence in situ hybridization,Western Blot,polymerase chain reaction,flow cytometric,gene chip and whole genome sequencing method.

Key words：Leukemia; Fusion gene; Detection method

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收稿日期：2015-02-25修回日期：2015-04-27編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.037

中圖分類號：R733.7

文獻標識碼：A