白血病融合基因及檢測方法研究進(jìn)展

肖　恒(綜述)，李守霞(審校)

(邯鄲市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 邯鄲 056001)

白血病融合基因及檢測方法研究進(jìn)展

肖恒(綜述)，李守霞※(審校)

(邯鄲市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 邯鄲 056001)

摘要：白血病是一種造血干細(xì)胞異?？寺≡鲋承约膊?，臨床表現(xiàn)主要為骨髓和外周血中白血病細(xì)胞大量增殖且分化障礙，其發(fā)病與融合基因的形成相關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)的融合基因主要有BCR-ABL、PML-RARA、AML1-ETO、CBFβ-MYH11、TEL/AML1、E2A/PBX1、MLL重排形成的基因、DEK-CAN等，對白血病的診斷和治療有重要意義。而檢測融合基因的方法主要包括熒光原位雜交、免疫印跡、聚合酶鏈反應(yīng)、流式細(xì)胞術(shù)、基因芯片及全基因組測序等方法。

關(guān)鍵詞：白血病；融合基因；檢測方法

白血病是一類起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病[1]，其克隆的白血病細(xì)胞增殖失控，分化障礙，凋亡受阻，并在骨髓和其他造血組織中呈惡性增生，使正常造血受抑制，且可浸潤其他組織和器官。近年來，隨著白血病融合基因的發(fā)現(xiàn)及細(xì)胞遺傳學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，白血病融合基因和細(xì)胞與分子遺傳學(xué)技術(shù)在白血病診斷中逐漸占據(jù)重要地位?，F(xiàn)就融合基因的表達(dá)在白血病診斷中的重要意義及其主要檢測方法進(jìn)行綜述。

1白血病融合基因

從在慢性粒細(xì)胞白血病中發(fā)現(xiàn)BCR-ABL融合基因以來，越來越多的融合基因不斷被發(fā)現(xiàn)，它們均由染色體重排形成，并成為白血病特異性的分子標(biāo)志，對認(rèn)識染色體重排在白血病形成中的作用研究提供了很大的幫助[2]，可用于白血病的分子生物學(xué)分型、預(yù)后觀察及微小殘留病(minimal residual disease，MRD)的診斷，目前常見于臨床的白血病融合基因主要有以下幾種。

1.1BCR-ABL融合基因最早在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞Ph染色體中發(fā)現(xiàn)，它由9q34上的原癌基因ABL與22q11上的BCR基因融合形成，即t(9；22)(q34；q11)。其編碼生成的BCR-ABL融合蛋白具有高酪氨酸激酶活性，它可通過激活下游多條信號通路而導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，并進(jìn)一步演變?yōu)榘籽　８鶕?jù)BCR斷裂點(diǎn)位置的不同，其編碼的蛋白分為p210、p230和p190融合蛋白。據(jù)報道，約95%以上的慢性粒細(xì)胞白血病患者和20%的急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)患者的白血病細(xì)胞中可表達(dá)BCR-ABL基因，因此BCR-ABL融合基因可用作慢性粒細(xì)胞白血病等白血病的分子診斷標(biāo)志物[3]。

1.2PML-RARA融合基因它通過t(15；17)(q22；q22)染色體易位后形成。RARA基因僅有1個斷裂點(diǎn)，位于2號內(nèi)含子，而PML基因有3個斷裂點(diǎn)，根據(jù)斷裂點(diǎn)位置的不同，分別形成長型(55%)、異構(gòu)體(5%)和短型(40%)3個亞型。PML-RARA的表達(dá)可干擾RARA在核內(nèi)的分布和對細(xì)胞分化的調(diào)控，使大量細(xì)胞阻滯在早幼細(xì)胞階段，從而導(dǎo)致急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的產(chǎn)生，可見于95%的APL患者，是APL的特異性分子標(biāo)志[4-5]。其不同的基因異構(gòu)體分型的預(yù)后有明顯不同，短型患者緩解前的病死率及緩解后的復(fù)發(fā)率均高于長型。此外，APL初診組和復(fù)發(fā)組的融合蛋白水平常較緩解組高，即PML/RARA融合基因可用于APL的療效觀察、預(yù)后判斷及監(jiān)測復(fù)發(fā)。

1.3AML1-ETO融合基因也被稱為RUNX1-RUNX1T1，由t(8；21)(q22；q22)易位形成[6]。AML1-ETO融合基因主要發(fā)生于M2型白血病，t(8；21)(q22；q22)陽性的AML患者中40%～50%為M2型，可作為M2b診斷的重要分子標(biāo)志，其他AML可見于M1、M4、M5。由其表達(dá)生成的AML1-ETO融合蛋白是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，可抑制正常AML1蛋白介導(dǎo)的功能，改變造血祖細(xì)胞自我更新及成熟過程，同時也產(chǎn)生啟動異常造血細(xì)胞增殖的信號，引起白血病細(xì)胞生長。當(dāng)其陽性時提示預(yù)后良好，完全緩解率高達(dá)90%，5年存活率達(dá)50%～70%。

1.4CBFβ-MYH11融合基因inv(16)(p13；q22)或t(16；16)(p13；q22)，可形成10余種CBFβ-MYH11融合基因轉(zhuǎn)錄本，但最常見的A亞型約占80%，D亞型占5%、E亞型占5%。它可干擾核結(jié)合因子CBF發(fā)揮作用，從而抑制造血分化和誘使細(xì)胞向白血病細(xì)胞轉(zhuǎn)化。但有敲入小鼠模型證明，CBFβ-MHY11本身并不足以導(dǎo)致白血病表型，可能還需要其他畸變同時存在時才能發(fā)揮作用[7]。據(jù)報道，約85.7%的M4EO患者CBFβ-MYH11融合基因表達(dá)陽性，且陽性提示預(yù)后良好。

1.5TEL/AML1融合基因?yàn)閠(12；21)(p13；q22)易位[8]，它可使AML1編碼的CBRa失去與DNA結(jié)合能力或不能正常轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮激活靶基因的作用,即AML1從轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)變成轉(zhuǎn)錄抑制因子，同時它表達(dá)生成的TEL/AML1融合蛋白還可與野生型AML1競爭結(jié)合DNA結(jié)合位點(diǎn)，抑制其正常的轉(zhuǎn)錄活性，使AML1調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)受抑，影響造血干細(xì)胞的自我更新和分化能力，是兒童前B-ALL時最常見的染色體異常之一，當(dāng)其陽性表達(dá)時常提示預(yù)后較好。

1.6E2A/PBX1融合基因t(1；19)(q13；p22)易位[9]，約見于5%的ALL患者中，在B細(xì)胞系A(chǔ)LL中占20%～30%，ALL患者初治期和復(fù)發(fā)期的E2A/PBX1融合基因表達(dá)均高于緩解期，且陽性表達(dá)者的無病生存率降低，即E2A/PBX1融合基因可作為ALL及MRD診斷的分子標(biāo)志，幫助判斷預(yù)后和指導(dǎo)治療。

1.7MLL重排形成的基因MLL基因位于11q23，白血病時尤其是AML時其可發(fā)生重排而形成融合基因，且種類和數(shù)目眾多，約占AML相關(guān)融合基因的3/5。如t(11；4)(q23；q21)易位形成的MLL/AF4融合基因，95%見于ALL[10]。此外，還有t(9；11)(p22；q23)形成的MLL/AF9融合基因，可見于86%的M5型AML[11]，及t(11；19)(q22；p13)形成的MLL-ENL 融合基因[12]等，幾乎全為AML，另還可見于拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑治療后產(chǎn)生的治療相關(guān)性AML。值得注意的是，通常情況下涉及MLL基因重排的白血病惡性程度較高，對常規(guī)化療不敏感，緩解率低，生存期短，是預(yù)后不良的標(biāo)志。

1.8DEK-CANt(6;9)(p23；q34)，是造血系統(tǒng)罕見的隨機(jī)染色體異常，可在1%的AML中發(fā)現(xiàn)。t(6；9)陽性的AML常預(yù)后不良，有報道顯示DEK-CAN融合蛋白并不能抑制造血祖細(xì)胞的分化，因此其致病機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步的研究[13]。

1.9其他融合基因除上述幾種融合基因外，近年來尚有許多新的融合基因型不斷被發(fā)現(xiàn)，如AML1/MTG8、SET-CAN、TEL-PDGFR、TLS-ERG、AML1-MDS1(EVI-1)等[14]，它們均將成為白血病診斷、預(yù)后及MRD診斷的重要分子生物學(xué)標(biāo)志。此外，一些正常核型急性髓性白血病發(fā)生的功能性基因突變，如flt3-itd/tkd[15]、C-kit[16]、mll-ptd[17]、npm1[18]等分子特征的發(fā)現(xiàn)，也為患者個體化治療提供了豐富的分子靶點(diǎn)。

2主要檢測技術(shù)

最初，白血病在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域的主要檢測方法為染色體顯帶技術(shù)，它可檢測出染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常的改變，如缺失、重復(fù)、插入、倒位和易位等，但其操作復(fù)雜且耗時，過程涉及的細(xì)節(jié)較多，對技術(shù)人員要求較高[19]。此外，它對監(jiān)測白血病患者的MRD方面效果也較差，這些都限制了其在白血病檢測中的應(yīng)用。

隨著人們逐漸認(rèn)識到MRD檢測在白血病復(fù)發(fā)和對白血病指導(dǎo)治療中的重要性，迫切需要能夠高特異性和高靈敏度檢測融合基因的方法[20]。近年來，研究人員們分別利用熒光原位雜交、免疫印跡、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometric，F(xiàn)CM)、基因芯片及全基因組測序等方法對白血病融合基因進(jìn)行了研究。現(xiàn)將這些主要檢測方法介紹如下。

2.1熒光原位雜交熒光原位雜交是一種通過標(biāo)記了熒光素的DNA按照堿基互補(bǔ)原則與待檢DNA進(jìn)行雜交后，利用出現(xiàn)的熒光信號的數(shù)量和位置來反映標(biāo)本中存在的相應(yīng)特異性基因的數(shù)量和位置的方法，利用該技術(shù)對白血病預(yù)后相關(guān)基因的檢測結(jié)果已作為白血病危險度分層的參考指標(biāo)[21]。它對處于分裂期和分裂間期的細(xì)胞均可以進(jìn)行檢測，具有形象直觀、靈敏度高、特異性強(qiáng)、無放射性、可進(jìn)行多重染色等優(yōu)點(diǎn)，且適用于血液、骨髓、組織等多種臨床標(biāo)本的檢測。但由于該方法實(shí)驗(yàn)步驟繁雜，過程中影響因素(溶液pH值、溫度時間等)較多，使熒光原位雜交在臨床的應(yīng)用有一定局限性。

2.2免疫印跡該法是應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)之一，它首先利用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，再將其轉(zhuǎn)移至固相載體(如硝酸纖維素薄膜)上，以目的蛋白或多肽作為抗原，與相應(yīng)抗體即第一抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，然后再與酶標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色來檢測目的基因表達(dá)的蛋白成分。如國內(nèi)白穎等[22]利用該法分別檢測了AML患者和正常人骨髓中DICER1融合基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DICER1基因在AML中的表達(dá)水平明顯高于正常對照組，其高表達(dá)可能是AML的不良預(yù)后因素。但該法實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件要求高，現(xiàn)仍主要用于科研活動中，在臨床中應(yīng)用較少。

2.3PCRPCR技術(shù)是一種特異耐熱酶(Taq DNA聚合酶)催化下完成的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸3個步驟反復(fù)的循環(huán)構(gòu)成。其基本原理是用寡聚核苷酸引物結(jié)合在模板DNA(或靶DNA)分子上進(jìn)行特異核苷酸序列擴(kuò)增。PCR是檢測白血病相關(guān)融合基因較為有效且敏感的方法，已應(yīng)用于白血病相關(guān)融合基因的PCR方法主要包括以下幾種。

2.3.1逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)它先以標(biāo)本中提取得到的信使RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出互補(bǔ)DNA，再以互補(bǔ)DNA為模板通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，是在RNA水平上檢測融合基因的方法。丁凱等[23]應(yīng)用RT-PCR方法檢測了急性白血病患者和健康者骨髓中PRAME基因的信使RNA表達(dá)水平，并與患者臨床資料行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)PRAME基因在急性白血病中表達(dá)率較高，可用于MRD的監(jiān)測。但由于RT-PCR是一種定性實(shí)驗(yàn)，不能對融合基因進(jìn)行定量，目前已經(jīng)被下述幾種PCR方法取代。

2.3.2實(shí)時定量熒光PCR(realtime quantity PCR,RQ-PCR)該方法是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，通過實(shí)時檢測熒光信號在PCR過程中的累積變化，利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知濃度的樣品進(jìn)行定量分析的方法，它可以直接檢測目的基因的起始數(shù)量，從而動態(tài)監(jiān)測融合基因水平。該方法具有快速簡便、靈敏度高、重復(fù)性好、可準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)，技術(shù)已較為成熟，被廣泛應(yīng)用于臨床檢測。黃賽等[24]使用RQ-PCR方法對433例初治AML患者中11例MLL-AF9融合基因陽性患者的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測分析，結(jié)果顯示，RQ-PCR檢測MLL-AF9融合基因可以反映患者M(jìn)RD的動態(tài)變化，與患者的臨床預(yù)后存在內(nèi)在相關(guān)性，是檢測預(yù)后的良好指標(biāo)，同時RQ-PCR可能有早期檢測分子生物學(xué)復(fù)發(fā)的潛力。RQ-PCR法可檢出1×106個有核細(xì)胞中的一個白血病細(xì)胞，比傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)方法及臨床癥狀出現(xiàn)早5～8個月，是現(xiàn)在臨床上應(yīng)用最廣、最多的方法。

2.3.3多重逆轉(zhuǎn)錄PCR(multiplex reverse transcription PCR，M-RT-PCR)該法又稱復(fù)合PCR或多重引物PCR，它的反應(yīng)原理和操作過程跟普通PCR相同，不同點(diǎn)在于它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對或多對引物，分別擴(kuò)增不同的目的片段，從而同時獲得多個核酸片段。該法在保留了普通PCR方法的高敏感性和高特異性的基礎(chǔ)上，極大地縮短了實(shí)驗(yàn)時間，提高了檢測效率。姜孟孟等[25]應(yīng)用多重巢式RT-PCR方法檢測了168例初治AML患者的骨髓標(biāo)本AML融合基因，結(jié)果表明有18例出現(xiàn)AML1融合基因，其中AML1-ETO、AML1-EV11、AML1-MDS1、AML1-MTG16、AML1-PRDM16、AML1-CLCA2陽性率依次為7.14%、1.19%、0.6%、0.6%、0.6%、0.6%。該法經(jīng)濟(jì)實(shí)用，檢測快速，在臨床應(yīng)用率也較高。但是，由于其僅能檢測已知的基因異常，而對未知的染色體易位和數(shù)量異常等無法識別，且樣本間易存在交叉污染等使其有一定的局限性。

2.4FCMFCM是對懸液中的單細(xì)胞或其他生物粒子通過檢測標(biāo)記的熒光信號，實(shí)現(xiàn)高速、逐一的細(xì)胞定量分析和分選的技術(shù)[26]。該法具有客觀、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、可定量的特點(diǎn)，能快速地對大量細(xì)胞逐個進(jìn)行多參數(shù)的測定和分析，還可對細(xì)胞進(jìn)行分選，目前被廣泛應(yīng)用于血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)等方面，是目前最熱門的科學(xué)研究方法之一。

近年來該法在檢測白血病的免疫分型及白血病患者M(jìn)RD等方面應(yīng)用逐漸增多，它主要利用白血病細(xì)胞與正常細(xì)胞的免疫表型特征的差異，對白血病細(xì)胞及MRD進(jìn)行檢測。有研究者對139例異基因造血干細(xì)胞移植后的急性淋巴細(xì)胞白血病患者，運(yùn)用四色FCM評估其MRD監(jiān)測的預(yù)后價值，發(fā)現(xiàn)移植后FCM陽性的患者同F(xiàn)CM陰性患者相比，前者具有較低的無事件生存率和較高的累積復(fù)發(fā)發(fā)生率[27]。目前白血病免疫分型已成為WHO有關(guān)血液系統(tǒng)惡性疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容，在歐美發(fā)達(dá)國家更是作為臨床血液系統(tǒng)腫瘤診斷與療效檢測不可缺少的依據(jù)。

但該方法在實(shí)際應(yīng)用時存在一定的缺陷，如一些化療后的非惡性淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞因與白血病淋巴細(xì)胞具有相似性而容易被誤認(rèn)，導(dǎo)致假陽性的發(fā)生，且敏感性方面也遠(yuǎn)不如PCR技術(shù)等。

2.5基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)指將大量探針分子固定于支持物表面，再與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測各個探針分子的雜交信號強(qiáng)度獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息的方法。該方法具有快速、簡便、分辨率高、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可以通過設(shè)計不同的探針陣列一次性對樣品大量序列進(jìn)行多項(xiàng)檢測和分析，此外還可用于突變基因的檢測和發(fā)現(xiàn)。早在1999年，Gulob等[28]已研制出用于白血病分型的基因芯片，近年來，應(yīng)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行白血病的轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)譜研究報道較多，但用于臨床診斷的基因芯片尚未問世，仍處于研究探索階段。

2.6全基因組測序全基因組測序即對一種生物的基因組中的全部基因進(jìn)行測序，測定其DNA的堿基序列。全基因組測序覆蓋面廣，能檢測個體基因組中的全部遺傳信息；準(zhǔn)確性高，其準(zhǔn)確度可高達(dá)99.99%，多應(yīng)用于科研，尚未常規(guī)應(yīng)用于臨床診斷[29]。Welch等[30]為確定全基因組測序是否可以識別基因突變，對1例帶有無致病性x-RARA融合基因的APL患者進(jìn)行末端配對測序方法檢測，發(fā)現(xiàn)了經(jīng)典的br3 PML-RARA融合基因，說明全基因組測序是突變檢測通用的穩(wěn)定的平臺。

3小結(jié)

白血病作為一種造血細(xì)胞克隆性疾病，細(xì)胞遺傳學(xué)改變在其發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。一方面，由于攜帶相同融合基因的患者在診斷和治療上存在一定的同質(zhì)性以及預(yù)后的可比性，融合基因檢測被廣泛地應(yīng)用于白血病的診斷分型及療效觀察。另一方面，監(jiān)測融合基因表達(dá)量還有助于臨床醫(yī)師進(jìn)一步在分子水平上確定白血病患者治療后是否獲得完全緩解，以便及時調(diào)整治療方案，減輕患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。此外，定期檢測MRD患者體內(nèi)融合基因表達(dá)水平，可更早預(yù)測白血病的復(fù)發(fā)，指導(dǎo)臨床治療，根據(jù)融合基因表達(dá)水平的多少，決定是否繼續(xù)化療，有利于評價治療效果，預(yù)測復(fù)發(fā)。綜上，檢測融合基因的方法雖種類多樣，但其各有優(yōu)缺點(diǎn)，為了取得較好的檢測結(jié)果，常常還是需要聯(lián)合使用幾種檢測方法。相信隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展和新的融合基因的不斷發(fā)現(xiàn)，白血病的診斷和分型將進(jìn)入一個嶄新的階段，同時利用分子生物學(xué)方法對融合基因進(jìn)行深入研究，如尋找白血病融合基因相關(guān)作用靶標(biāo)、研究靶向治療藥物等，將為白血病的個性化治療提供更加有力的支持。

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著錄參考文獻(xiàn)可以反映論文作者的科學(xué)態(tài)度和論文具有真實(shí)、廣泛的科學(xué)依據(jù)，也反映出該論文的起點(diǎn)和深度；可以把論文作者的成果與前人的成果區(qū)別開來；可以起到情報檢索與文獻(xiàn)計量研究作用；可以節(jié)省論文篇幅。

Advances in Leukemia Fusion Gene and the Detection TechnologyXIAOHeng,LIShou-xia.(ClinicalLaboratoryofHandanCentralHospital,Handan056001,China)

Abstract：Leukemia is a kind of hyperplastic disease of abnormal hematopoietic stem cell cloning,and the main clinical manifestation is the proliferation and abnormal differentiation of leukemia cells in bone marrow and peripheral blood,which is associated with the formation of fusion gene.So far the discovered fusion genes mainly inlcude BCR-ABL,PML-RARA,AML1-ETO,CBFβ-MYH11,TEL/AML1,E2A/PBX1,MLL rearrangement genes and DEK-CAN,which are of great significance for the diagnosis and treatment of leukemia.Detection methods of fusion genes mainly include fluorescence in situ hybridization,Western Blot,polymerase chain reaction,flow cytometric,gene chip and whole genome sequencing method.

Key words：Leukemia; Fusion gene; Detection method

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收稿日期：2015-02-25修回日期：2015-04-27編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.037

中圖分類號：R733.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A