膜迷路積水動(dòng)物模型造模方法的研究進(jìn)展*

陳茜茜，蔣麗元，陳華德

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053）

梅尼埃病（Meniere’s disease，MD）是以反復(fù)發(fā)作性、自發(fā)性、陣發(fā)性眩暈，聽(tīng)力損失，耳悶、耳鳴等為主要臨床表現(xiàn)的特發(fā)性膜迷路積水綜合征。1861年法國(guó)醫(yī)生首次報(bào)道了梅尼埃病，Hallpike 等[1]最先提出了梅尼埃病病人的病理改變?yōu)槟っ月贩e水。后來(lái)人們逐漸認(rèn)識(shí)到，膜迷路積水是許多內(nèi)耳疾病相同的病理改變，而MD 僅為其中的一種。鑒于人耳的特殊性，很多實(shí)驗(yàn)只能靠建立動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行，因此，動(dòng)物模型的制作在梅尼埃病的研究中占據(jù)了很重要的地位。本文將目前膜迷路積水動(dòng)物模型的造模方法及特點(diǎn)等綜述如下。

1 手術(shù)法

Kimura 等[2]通過(guò)手術(shù)來(lái)阻塞豚鼠內(nèi)淋巴管和破壞內(nèi)淋巴囊，首次成功在豚鼠體內(nèi)復(fù)制出了膜迷路積水的動(dòng)物模型。Konishi[3]在此基礎(chǔ)上，創(chuàng)立了后顱窩硬膜外進(jìn)路法，此法只破壞了部分骨內(nèi)淋巴囊和淋巴導(dǎo)管，對(duì)枕骨破壞小，也減少了對(duì)硬腦膜和乙狀竇的刺激，存活率也較之前高。Dunnebier[4]探索出了一種不破壞前庭導(dǎo)水管的新方法。具體方法為：模型分為2 組，第1 組分離乙狀竇和遠(yuǎn)端淋巴囊，其間填充明膠海綿；第2 組用硝酸銀燒灼附于乙狀竇骨外的淋巴囊，不填充任何物質(zhì)。手術(shù)23d 后取材，觀察到第1 組大部分豚鼠中度到重度積水，部分輕度積水，最嚴(yán)重的部位在頂轉(zhuǎn)，其次是底轉(zhuǎn)；第2 組部分輕度積水。Dunnebier 認(rèn)為，內(nèi)淋巴囊對(duì)于淋巴液的吸收是雙向的。所以使淋巴囊和乙狀竇完全分離是制作MD 模型更好的手術(shù)方法，能使我們更好地觀察MD 的病理生理學(xué)，從而也證明了骨內(nèi)的淋巴囊在調(diào)理膜迷路積水中起著重要的作用。

手術(shù)方法制作MD 模型成功率高，但是難度大，操作技術(shù)要求嚴(yán)格，動(dòng)物易感染致死。

2 內(nèi)分泌調(diào)節(jié)法

有研究發(fā)現(xiàn)MD 患者血清中抗利尿激素（ADH）水平在病情發(fā)作時(shí)明顯高于正常人[5]，說(shuō)明ADH 在MD 的致病機(jī)理中起著一定的作用。Kumagami 等[6]認(rèn)為，血管加壓素（AVP）對(duì)膜迷路積水的影響是通過(guò)內(nèi)淋巴囊對(duì)內(nèi)淋巴液的重吸收實(shí)現(xiàn)的。其實(shí)驗(yàn)方法如下：通過(guò)對(duì)豚鼠腹腔注射血管加壓素，0.5 單位/g·d-1，連續(xù)注射60d，制作出了慢性膜迷路積水模型，成功率為70%，其中30%中輕度積水，40%重度積水，并指出：內(nèi)淋巴囊可能是AVP依賴調(diào)節(jié)的靶器官，在內(nèi)淋巴囊中可能存在AVPV2R-cAMP-AQP2 通道，AVP 在內(nèi)耳通過(guò)作用于淋巴囊上皮細(xì)胞，減少內(nèi)淋巴囊對(duì)淋巴液重吸收而引起膜迷路積水。

醋酸去氨加壓素是ADH 的類(lèi)似物，邢巍巍等[7]通過(guò)腹腔注射醋酸去氨加壓素的方法制備豚鼠膜迷路積水模型，4μg/kg·d-1，連續(xù)注射1 周。1 周后觀察到部分豚鼠有水平性眼震，但時(shí)間無(wú)特定性，第3周部分豚鼠出現(xiàn)走路蹣跚，ABR 閾值較對(duì)照組升高。耳蝸組織切片觀察到了40%中度積水，60%重度積水，積水程度從頂轉(zhuǎn)到底轉(zhuǎn)逐步加重，部分前庭膜有破裂，AQP-2 在蝸管外側(cè)壁、螺旋神經(jīng)節(jié)及Corti 氏器等處表達(dá)增加。該方法操作簡(jiǎn)單，模型成功率較腹腔注射血管加壓素高，但是在模擬MD 的臨床表現(xiàn)方面仍較差。

蔣子棟等[8]在Dunnebier[9]兩期法的啟發(fā)下，發(fā)現(xiàn)單純腹腔注射醛固酮也可以制做出膜迷路積水的模型。具體方法如下：豚鼠腹腔注射醛固酮，0.1mg/kg.d-1，連續(xù)注射5d。觀察到1 個(gè)月后開(kāi)始出現(xiàn)輕度積水，并隨時(shí)間變長(zhǎng)而加重，從底轉(zhuǎn)開(kāi)始，2個(gè)月之內(nèi)發(fā)展成了中度和重度，ABR 閾值較實(shí)驗(yàn)前明顯提高。

3 透明質(zhì)酸凝膠蝸?lái)斪⑸浞?/h2>

Salt 等[10]通過(guò)豚鼠耳蝸?lái)斵D(zhuǎn)注射透明質(zhì)酸凝膠的方法來(lái)誘導(dǎo)膜迷路積水模型，觀察到傳感位點(diǎn)的持續(xù)性變化，Corti’s 器向鼓階移動(dòng)，而耳蝸內(nèi)電位和復(fù)合動(dòng)作電位的變化與Corti’s 器的移位相一致。并推測(cè)可能的原因?yàn)椋涸谧⑸溥^(guò)程中，鼓階底轉(zhuǎn)產(chǎn)生的壓力使前庭階和外淋巴液之間產(chǎn)生了微小的壓力差而使凝膠從鼓階滲透到耳蝸導(dǎo)水管，引起Corti’s 器向鼓階的移動(dòng)。該方法誘導(dǎo)的膜迷路積水可以模擬出Corti’s 器持續(xù)性向鼓階凸出的病理改變，耳蝸內(nèi)部的電位變化也有助于解釋MD 患者對(duì)外界低頻壓力改變的敏感性。

4 人工淋巴液注射法

通過(guò)向鼓膜直接注射人工淋巴液是誘導(dǎo)膜迷路積水最直接最快速的方法。Kakigi 等[11]觀察到，往豚鼠鼓膜內(nèi)連續(xù)注入淋巴液大于3μL 時(shí)，外淋巴液中鉀離子的濃度明顯升高，并認(rèn)為這是MD 病患者前庭功能障礙的原因之一。Brown 等[12]通過(guò)微管在豚鼠內(nèi)耳蝸中階緩慢注入人工淋巴液，觀察到復(fù)合動(dòng)作電位的閾值升高，基底膜向鼓階移動(dòng)；通過(guò)向橢圓囊注入人工淋巴液，觀察到前庭誘發(fā)動(dòng)作電位的降低，瞬時(shí)敏感性增加。而耳蝸內(nèi)電位變化隨著注射速度的快慢具有明顯的波動(dòng)性。這有助于解釋MD 患者波動(dòng)性的病情變化。

5 噪聲暴露法

Salt[13]將豚鼠置于200Hz 的低頻噪聲環(huán)境中，給聲強(qiáng)度為115dB SPL，3min 后觀察到，膜迷路積水約增加30%，并在暴露結(jié)束后數(shù)分鐘恢復(fù)，造成了快速的暫時(shí)性的聽(tīng)力損傷和膜迷路積水。屈立新等[14]將豚鼠置于4kHz 的窄帶噪聲環(huán)境中，給聲強(qiáng)度為120dB SPL，刺激時(shí)間為4h，觀察到ABR 閾值明顯升高后，Caspse-12 蛋白含量在噪聲刺激后迅速增高，耳蝸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞（SGC）不同程度地凋亡，并指出Caspase-12 活化介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與噪聲引起耳蝸SGC 凋亡的過(guò)程，能造成模型永久性的聽(tīng)力損失。噪聲暴露法能快速建立有效的膜迷路積水動(dòng)物模型，但該方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的積水并不穩(wěn)定。

6 免疫法

Watanabe 等[15]用KLH 誘導(dǎo)膜迷路積水動(dòng)物模型，先通過(guò)全身KLH 致敏，2 周后再次加強(qiáng)免疫，之后將KLH 注入內(nèi)淋巴囊行局部免疫，觀察到Reissner’s 膜不同程度地凸向前庭階，檢測(cè)到了從底轉(zhuǎn)到頂轉(zhuǎn)的一氧化氮合酶（iNOS）免疫反應(yīng)，并提出假設(shè)：iNOS 合酶在膜迷路積水中起著調(diào)節(jié)作用。通過(guò)免疫法誘導(dǎo)膜迷路積水發(fā)生率較高，能模擬出MD的病理改變，但造模后模型不穩(wěn)定，觀察周期較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)研究較少用。

7 綜合法

Segenhout 等[16]利用兩期法的原理，先分離豚鼠左耳遠(yuǎn)端的淋巴囊，之后腹腔注射注射醛固酮，100μg/g·d-1，連續(xù)注射5d，成功制備聽(tīng)力損傷的膜迷路積水動(dòng)物模型。Dunnebier 和Segenhout[17]再一次通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了此制作方法的優(yōu)越性。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于，很接近MD 患者波動(dòng)性的聽(tīng)力變化。手術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生的膜迷路積水主要引起頂轉(zhuǎn)低頻聽(tīng)力的下降，醛固酮主要引起底轉(zhuǎn)高頻聽(tīng)力的下降，是較為理想的模型。

Kim 等[18]通過(guò)腹腔注射醛固酮聯(lián)合鼓室注入脂多糖（LPS）的方法來(lái)誘導(dǎo)膜迷路積水的動(dòng)物模型。其方法具體如下：腹腔注射醛固酮100μg/100g·d-1，與此同時(shí)，通過(guò)左耳鼓膜將脂多糖注入到左鼓室，1mg/d，連續(xù)注射5d。耳蝸切片結(jié)果顯示，耳蝸輕度到中度的水腫，在血管紋處壓力滲透蛋白94（OSP94）顯著提高，但是仍然沒(méi)有模擬出前庭神經(jīng)功能紊亂的臨床癥狀。

8 Phex 基因鼠模型

這種模型為PhexHyp 和PhexGy，即位于X 線染色體[19-20]上的具有造成同源性肽酶的磷酸調(diào)節(jié)功能喪失的基因模型。但是雄性PhexGy 鼠不育，從而失去了其作為研究工具的有用性。Lorenz 等[21]報(bào)道了一種新的動(dòng)物模型，PhexHyp-Duk，該種小鼠會(huì)表現(xiàn)出盤(pán)旋等前庭功能損害的征象，包括前庭中階的腫大和聽(tīng)力的損失，并隨年齡增長(zhǎng)積水程度逐漸加重。Megerian 等[22]指出，該種小鼠在出生后會(huì)出現(xiàn)自發(fā)性的內(nèi)耳功能損害，包括盤(pán)旋，頭上下?lián)u動(dòng)，步態(tài)不穩(wěn)，該表現(xiàn)在出生后15d 即開(kāi)始出現(xiàn)，到30d 的時(shí)表現(xiàn)已經(jīng)非常明顯。該模型可以作為一個(gè)較理想的模型來(lái)研究MD，因?yàn)樗⒉恍枰中g(shù)干預(yù)。

Ichikawa 等[23]發(fā)現(xiàn)，Phex 基因的突變量可能會(huì)對(duì)礦物離子的代謝產(chǎn)生影響。從而影響其對(duì)細(xì)胞外磷酸鹽濃度的設(shè)置點(diǎn)。Semaan 等[24]提出假說(shuō)，PhexHyp-Duk 鼠產(chǎn)后膜迷路積水進(jìn)行性惡化的機(jī)制可能與內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)。Wick 等[25]在總結(jié)該鼠模型時(shí)指出，Phex 基因鼠模型膜迷路積水的發(fā)展并不是完全由于基因的缺失，而且該模型內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元細(xì)胞的死亡先于內(nèi)耳聽(tīng)細(xì)胞，所以觀察內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡變性，實(shí)時(shí)性的病理診斷，以及未來(lái)神經(jīng)元的保護(hù)治療可能會(huì)成為以后研究MD 的新著手點(diǎn)。

9 總結(jié)與展望

綜上所述，誘導(dǎo)膜迷路積水的動(dòng)物模型方法各異，原理也各不同，但都存在自己的局限性，而且造模后對(duì)模型的臨床表現(xiàn)的觀察時(shí)間都偏短，雖幾經(jīng)改進(jìn)，但MD 的臨床癥狀模擬仍未到達(dá)很理想的狀態(tài)。盡管如此，這些造模方法還是對(duì)MD 的病因病理以及發(fā)病機(jī)制的研究帶來(lái)了很大的促進(jìn)作用。近幾年發(fā)展起來(lái)的的Phex 鼠膜迷路積水動(dòng)物模型作為MD 的研究雖較為理想，但是因?yàn)榛蛉笔Ф鴰?lái)的對(duì)于模型本身其它方面影響仍需要做進(jìn)一步的研究。

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