白花鬼針草乙酸乙酯部位對R KO細(xì)胞線粒體膜電位的影響

吳建國，吳巖斌，萬仲賢，鄒秀紅，吳錦忠

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.永春縣林業(yè)局，福建 永春 362600）

白花鬼針草（Bidenspilosavar.radiata Schult.Bip.）為菊科植物白花鬼針草的全草，為泛熱帶性植物，是民間草藥，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀活血的功效，主要用于治療癰腫瘡癤、感冒發(fā)熱、濕熱黃疸、風(fēng)濕痹痛等［1］。我們前期研究表明白花鬼針草乙酸乙酯部位（E E－B P）含有多個(gè)黃酮類化合物［2］，能顯著誘導(dǎo)結(jié)腸癌R KO細(xì)胞的凋亡［3］。線粒體膜電位（△Ψm）的破壞是細(xì)胞凋亡早期發(fā)生的一個(gè)標(biāo)志性事件，細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體膜電位的變化使得膜的通透性發(fā)生改變。膜通透性的增加，使得線粒體蛋白包括細(xì)胞色素C等，從線粒體基質(zhì)釋放到細(xì)胞漿。細(xì)胞色素C的釋放伴隨膜電位的完全喪失，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡酶的級(jí)聯(lián)效應(yīng)［4］。我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，以J C－1（5，5＇，6，6＇－四氯－1，1＇，3，3＇－四乙基苯并咪唑羰花青碘化物）為熒光探針檢測E E－B P對結(jié)腸癌R KO細(xì)胞線粒體膜電位的影響。

1 材 料

1.1 藥物和細(xì)胞株 白花鬼針草購自福建省泉州市永春縣藥材市場，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊成梓副教授鑒定為菊科植物鬼針草屬白花鬼針草Bidenspilosavar.radiata Schult.Bip.的全草，人結(jié)腸癌R KO細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命學(xué)院細(xì)胞資源中心。

1.2 試劑 石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清（美國Hyclone公司）；青霉素－鏈霉素雙抗試劑（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）；細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.3 儀器YXQ－LS－70A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SW－CJ－1FDA超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；BCD－518WSA冰箱（中國海爾集團(tuán)有限公司）；Eppendorf移液器、5417R高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；AnkeTDL－50B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HF212UVCO2培養(yǎng)箱（香港HealForce公司）；D K－420型電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國B D公司）。

2 方 法

2.1 乙酸乙酯部位制備 將干燥的白花鬼針草全草10k g置于多功能提取濃縮機(jī)組提取罐中，加75%的乙醇，浸泡12h，加壓回流提取2次；合并提取液，過濾并減壓濃縮，得到白花鬼針草的乙醇總提取物。總提取物以水混懸后，用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，乙酸乙酯萃取液經(jīng)過減壓濃縮、干燥后，得乙酸乙酯部位（EE－BP）。

2.2 含藥培養(yǎng)液的制備取EE－BP以DMSO溶解后，配置成0、25、50、100μg／m L的含藥培養(yǎng)液（含10%FBS、1%雙抗的DMEM 溶液），以0.22μm微孔濾膜過濾除菌后密封，保存于4℃，備用。

2.3 R KO細(xì)胞線粒體膜電位檢測 R KO細(xì)胞置于含10%F B S的低糖DMEM培養(yǎng)液的6孔板中，37℃、5%C O2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24h后，棄培養(yǎng)液；0、25、50、100μg／m L的含藥培養(yǎng)液，干預(yù)12h后，胰蛋白酶消化后重懸；離心收集5×105細(xì)胞，PBS洗滌2遍；加入500μL的JC－1工作液吹打，將細(xì)胞混懸，并在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育20min，離心，棄上清；加入500μL的Incubation Buffer溶液重新混懸細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。

3 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、圖1～圖4。

表1 E E－B P對R KO細(xì)胞線粒體膜電位的影響（±s）

表1 E E－B P對R KO細(xì)胞線粒體膜電位的影響（±s）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.01。

2550100線粒體膜電位 34.27±0.7410.26±1.551） 22.96±2.871） 29.92±3.451）組 別 n 空白對照組 E E－B P組／（μg／m L）

4 討 論

在空白對照組中，△Ψm較高，部分以聚合體的形式存在，紅色熒光強(qiáng)。隨著E E－B P給藥濃度的不斷增加，紅色熒光不斷減弱，△Ψm去極化，J C－1部分以單體的形式存在，發(fā)出綠色熒光，其丟失率隨著給藥的濃度增加而增加，具有顯著性差異，P＜0.01，說明E E－B P可以通過降低△Ψm，誘導(dǎo)R KO結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。

［1］中華本草編委會(huì) .中華本草［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：735.

［2］WU J G，WAN Z X，WU Y B，et al.CHEMICAL CONSTITUENTS OF Bidens pilosavar.radiate［J］.Chem Nat Comp，2013，49（4）：759－760.

［3］WU J G，WAN Z X，Y I J，et al.Investigation of the extracts from Bidens pilosa Linn.var.radiata Sch.Bip.for antiox idantactivities and cytotoxicity against human tumor cells［J］.JNa t Med，2013，67（1）：17－26.

［4］姚成才，涂遠(yuǎn)榮，姜杰，等 .欖香烯乳誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑逆轉(zhuǎn)肺癌A 549／DDP細(xì)胞株耐藥［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué).2014，22（6）：1276－1281.