冬蟲夏草多糖肽的提取與制備

陳肖虹，黃宏南

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；2.福建省疾病預(yù)防控制中心，福建 福州 350001）

多糖肽是一種糖蛋白，是多糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合體。真菌多糖肽一般都具有抗腫瘤活性和提高免疫力的生物活性。國內(nèi)期刊數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，關(guān)于冬蟲夏草中蟲草素、蟲草酸、腺苷等成分的研究已十分普遍，然而關(guān)于蟲草多糖的研究報道主要集中在近十年且較少，而對蟲草多糖肽的研究則難覓蹤跡。因此，包含多糖肽在內(nèi)的多糖類成分將是蟲草開發(fā)研究的一個重要突破口。本研究提出一種制備冬蟲夏草多糖肽（純度＞95%）的方法，可用于該類產(chǎn)品的測定，此項(xiàng)研究尚未見文獻(xiàn)記載。

1 研究背景

多糖肽引起醫(yī)藥界廣泛興趣源于1977年，日本吳羽化學(xué)（Kureha Chemicals）利用熱水萃取法和硫酸胺鹽析法純化出CM101品系云芝菌絲體的云芝糖肽［1］。1989 年楊 慶堯等［2-3］改用熱 水 浸取和 醇析法萃取出 Cov-1品系云芝菌絲體中的云芝糖肽（polysaccharide peptides，PSP）。近年來學(xué)者對真菌多糖肽的研究偏少，主要是從云芝、靈芝屬等中提取多糖肽。在提取與制備方法上，傳統(tǒng)的云芝糖肽多以干燥的菌絲體為材料，用鹽析法、水提醇沉法等提取制備，但這些方法所得產(chǎn)品都是粗制品，含有大量鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪等，須用層析法等進(jìn)行條件優(yōu)化得到純品。靈芝屬多糖肽，既有用子實(shí)體也有用菌絲為材料，同樣多采用熱水浸提和乙醇沉淀的方法制備［4-6］。 2007 年 Jung-Young 等［7-8］從蜂頭蟲草（Cordyceps sphecocephala）J-201菌絲深層發(fā)酵液中通過乙醇沉淀法提取出PSP。因此，本文采用乙醇沉淀法制備冬蟲夏草多糖肽，但由于不同真菌產(chǎn)生的多糖肽在量化性質(zhì)上稍有差別，所以在具體提取工藝流程和條件上較之前研究有區(qū)別。

2 制備方案

在制備冬蟲夏草多糖肽之前，首先需要獲得含有高分子量的多糖肽溶液，本課題以冬蟲夏草純粉為原料的水提取液，將其濃縮、離心、透析、截留而獲得的含有高分子量的冬蟲夏草多糖肽。冬蟲夏草多糖肽溶液的工藝流程見圖1，得到冬蟲夏草多糖肽純品。本節(jié)給出的是通用的實(shí)施方式，其本質(zhì)是乙醇沉淀法。

2.1 粗品制備 用濃度為1%的冬蟲夏草多糖肽溶液，在不斷攪拌中緩慢滴加無水乙醇至原體積的一半，即 1∶0.5（V／V），置冰箱過夜，離心（10000～12000 r／min），用無水乙醇分級沉淀，收集 33%乙醇沉淀部分，置冰箱，真空干燥得第1級成分為冬蟲夏草多糖肽I。取上清液再滴加無水乙醇至1∶1（V／V），置冰箱過夜，離心（10000～12000 r／min），用無水乙醇分級沉淀，收集33%～50%的沉淀，置冰箱真空干燥得第2級成分為冬蟲夏草多糖肽Ⅱ。將上清液繼續(xù)加乙醇至 1∶1.5（V／V），得第 3級成分冬蟲夏草多糖肽Ⅲ，置真空低溫干燥得冬蟲夏草多糖肽粗品。

2.2 純品制備 取冬蟲夏草多糖肽Ⅲ （冬蟲夏草多糖肽粗品）以1∶10比例加水微熱溶解，離心去雜，通過聚丙烯胺凝膠Bio-Gel系列多次柱分離，用含50 mol／L NaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（pH＝5.8～6.0，0.2 mol／L），透析 12～20 h，取袋內(nèi)液濃縮，用3倍無水乙醇沉淀，離心，收集沉淀部分，冷凍干燥，得淺褐色粉末狀物質(zhì)為冬蟲夏草多糖肽。

3 制備和HPLC法測定

3.1 制備實(shí)例 為驗(yàn)證本文提出的制備工藝，本文借助福建省疾病預(yù)防控制中心理化實(shí)驗(yàn)室實(shí)施了多次實(shí)驗(yàn)，本節(jié)給出一個實(shí)施案例如下。

3.1.1 實(shí)施步驟1 用濃度為1%的冬蟲夏草多糖肽溶液，在不斷攪拌中緩慢滴加無水乙醇至1∶0.5（V／V），置冰箱過夜，用 11000 r／min 離心，用無水乙醇分級沉淀，收集33%乙醇沉淀部分，置冰箱真空干燥得冬蟲夏草多糖肽I。

3.1.2 實(shí)施步驟2 取“3.1.1”項(xiàng)中沉淀后上清液滴加無水乙醇至1∶1（V／V），同上處理后收集33%～50%的沉淀，置冰箱真空干燥得冬蟲夏草多糖肽Ⅱ。

3.1.3 實(shí)施步驟3 將“3.1.2”項(xiàng)沉淀后上清液再加乙醇至 1∶1.5（V／V），得冬蟲夏草多糖肽Ⅲ，置真空低溫干燥即得冬蟲夏草多糖肽粗品。

3.1.4 實(shí)施步驟4 取“3.1.3”項(xiàng)所得冬蟲夏草多糖肽粗品以1∶10比例加水微熱溶解，用11000 r／min離心去雜，通過聚丙烯胺凝膠Bio-Gel系列多次柱分離，用含50 mol／L NaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（pH＝5.9，0.2 mol／L），透析 16 h，取袋內(nèi)液濃縮，用3倍無水乙醇沉淀，離心，收集沉淀部分，冷凍干燥，得淺褐色粉末狀物質(zhì)為冬蟲夏草多糖肽純品。

3.2 HPLC法測定

3.2.1 測定方法及條件 采用HPLC-PDA法測定。主要儀器為：Waters e2695型高效液相色譜儀系統(tǒng)，Waters e2996型二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Beckman Coultcr高速離心機(jī)；MILLIPORE direct-Q純水系統(tǒng)。色譜條件為色譜柱：Atlantis T3柱 （4.6×250 mm，5 μm）；柱溫：35℃；流動相：體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇水溶液，流速為 1.0 mL／min，進(jìn)樣量為 10 μL；檢測器為二極管陣列檢測器，掃描波長為190～460 nm。對照所用標(biāo)準(zhǔn)品采用的是國家菌草工程技術(shù)研究中心的冬蟲夏草多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞98%。

3.2.2 測定結(jié)果 取上述實(shí)施案例制備的冬蟲夏草多糖肽純品，經(jīng)前處理后用HPLC-PDA檢測并與標(biāo)準(zhǔn)品對照，結(jié)果顯示為冬蟲夏草多糖肽單峰（見圖2和圖3），無糖峰和肽峰分開出現(xiàn)的現(xiàn)象。此外，在掃描波長190～460 nm范圍內(nèi)，制備的冬蟲夏草多糖肽純品的最大吸收波長為192.3 nm，這也與標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長192.3 nm相同，雙重定性可以確定制備所得確是冬蟲夏草多糖肽。并經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，利用本文所述的制備工藝所得冬蟲夏草多糖肽純度均在95%以上，因而可在測定冬蟲夏草產(chǎn)品質(zhì)量檢測應(yīng)用中用作對照品。

圖2 冬蟲夏草多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

圖3 冬蟲夏草多糖肽純品的色譜圖

4 結(jié) 語

本文提出了一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法，此項(xiàng)研究國內(nèi)尚未見報道。制備實(shí)驗(yàn)和HPLC測定結(jié)果顯示，利用本文所述方法可以制備冬蟲夏草多糖肽，且純度＞95%，可用于冬蟲夏草多糖肽制品如保健品的測定。

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