正交試驗(yàn)法優(yōu)選消腫活血合劑的提取工藝

王瓊珺，高偉城

（漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，福建 漳州363000）

消腫活血合劑源于漳州市中醫(yī)院骨科的經(jīng)驗(yàn)處方，由當(dāng)歸尾、赤芍、黃柏、陳皮、澤蘭、蒼術(shù)等10味中藥制成，具有活血化瘀、消腫止痛之功。該方用于治療跌打損傷和骨折初期所致的肢體腫脹、疼痛、瘀血等，臨床運(yùn)用幾十年，療效確切。該方以當(dāng)歸尾、赤芍為君藥，活血化瘀，配合黃柏、澤蘭、忍冬藤以清熱涼血、散瘀消腫，以防損傷初期瘀血化熱之證，共為臣藥；用人中白、兩面針、大丁癀托里定痛，祛瘀止血，為佐藥；以陳皮、蒼術(shù)為使藥，固衛(wèi)脾胃，以免克伐之弊。為控制產(chǎn)品的質(zhì)量，穩(wěn)定制劑的工藝，給患者提供更加安全有效的口服制劑，本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法對(duì)原制劑的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為生產(chǎn)工藝的確立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AgiLent 1200高效液相色譜（包括真空脫氣機(jī)、四元梯度泵、紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、Ver 08.01-Chemistation化學(xué)工作站）；電子天平 BP211D（1／100000 g），德國(guó) Sartorius；電子天平 BSA4202S（0.01 g～4200 g），德國(guó) Sartorius；電煎藥鍋，長(zhǎng)沙市雨花區(qū)中誠(chéng)制藥機(jī)械廠；R201B旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀，上海申生科級(jí)科技有限公司；KEJ-1000型超聲波清洗機(jī)，張家港科凈超聲洗凈設(shè)備有限公司。

1.2 試藥 赤芍、當(dāng)歸尾、忍冬藤、兩面針、大丁癀、澤蘭、陳皮、黃柏、蒼術(shù)、人中白，經(jīng)漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院中藥教研室蔡揚(yáng)帆副教授鑒定為合格藥材。芍藥苷對(duì)照品 （中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110736-200732，純度 98.1%）、甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)TEDIA“天地”試劑公司）、超純水（艾柯超純水機(jī)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 取消腫活血方（歸尾40 g，赤芍 64 g，兩面針 64 g，大丁癀 64 g，澤蘭 64 g，陳皮40 g，黃柏 32 g，蒼術(shù) 16.8 g，忍冬藤 64 g，人中白23.3 g）1／4 量藥材，以加水倍數(shù)（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）為考察因素，各因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，以芍藥苷含量、干浸膏得率及綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，按 L9（34）正交表安排試驗(yàn)［1-2］。 因素水平見(jiàn)表 1。

2.2 水煎提取試驗(yàn) 按處方量稱取9份樣品，按因素水平表和試驗(yàn)表，進(jìn)行水煎煮提取。每份加水后浸泡1 h，煎液濃縮至250 mL。

2.3 干浸膏得率測(cè)定方法 精密移取提取液25.00mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃真空干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計(jì)算，即得［3］。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 L9（34）水提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

干浸膏得率＝（干浸膏重／11.8）×100%

2.4 芍藥苷含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：zorbax SB C18柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05 moL／L磷酸二氫鉀（40∶60）；流速：1.0 mL／min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：15 μL。芍藥苷對(duì)照品、消腫活血合劑樣品和缺赤芍的陰性對(duì)照樣品的HPLC色譜圖，見(jiàn)圖1～圖3。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密稱取芍藥苷對(duì)照品14.07 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL甲醇中含芍藥苷276.05 μg的對(duì)照品母液。分別精密吸取對(duì)照品母液1、2、3、4、5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇制成不同濃度的對(duì)照品溶液。精密吸取15 μL，分別注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣濃度（μg／mL）為橫坐標(biāo)X，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。芍藥苷回歸方程為：Y＝38.379X－25.571 （r＝0.9998）， 表明在11.042～55.210 μg／mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 芍藥苷對(duì)照品HPLC色譜圖

圖2 消腫活血合劑樣品HPLC色譜圖

圖3 陰性對(duì)照樣品（缺赤芍）HPLC色譜圖

采用的高效液相測(cè)定法方法驗(yàn)證結(jié)果：空白試驗(yàn)無(wú)干擾，加樣回收率平均為99.4%，RSD＝0.75%（n＝6），表明方法準(zhǔn)確度良好；對(duì)照品溶液精密度0.31%（n＝6），表明儀器的精密度良好；供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為0.59%（n＝6），并且24 h基本穩(wěn)定；重復(fù)性試驗(yàn)RSD值為0.91%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 供試品溶液的制備與測(cè)定 取消腫活血合劑1 mL至25 mL量瓶，加甲醇溶解，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。精密吸取15 μL進(jìn)樣，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算芍藥苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.4 綜合評(píng)分 綜合得分［4］＝［（芍藥苷含量 ／最大值）×0.5＋（出膏率 ／最大值）×0.5］×100。

2.5 試驗(yàn)結(jié)果與方差分析 見(jiàn)表3。結(jié)果表明，影響芍藥苷含量和干浸膏得率綜合指標(biāo)最大的因素是煎煮次數(shù)，其次是加水量，最后是煎煮時(shí)間。由方差分析表3可知：煎煮次數(shù)和加水量有顯著性差異，提取時(shí)間無(wú)顯著性差異。最佳提取條件為：提取條件C3A2B2。即最佳條件為煎煮3次，每次煎煮1.5 h。結(jié)合直觀分析與實(shí)際生產(chǎn)，確定最佳水提取工藝為煎煮3次，加10倍量的水，每次1.5 h。

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

2.6 工藝驗(yàn)證 結(jié)果3批樣品芍藥苷的含量分別為 885.21、884.62 和 884.35 μg／mL， 干浸膏得率分別為23.01%、22.98%和22.93%。表明正交試驗(yàn)選出的工藝條件合理，工藝條件穩(wěn)定可行。

3 討 論

3.1 當(dāng)歸尾具有補(bǔ)血活血之功效，為本方的君藥。以含量測(cè)定指標(biāo)成分代表性分析，當(dāng)歸尾中的阿魏酸最為適宜。原試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用芍藥苷含量、阿魏酸含量、干浸膏得率三者綜合得分為指標(biāo)。在測(cè)定歸尾中阿魏酸含量時(shí)，陰性對(duì)照有干擾。赤芍其主要成分為芍藥苷，具有解痙、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗?jié)兊茸饔?，亦為本方的君藥，其含量可作為工藝?yōu)選的主要依據(jù)之一。故實(shí)驗(yàn)選用測(cè)定芍藥苷的含量及干浸膏得率為綜合指標(biāo)考察水煎煮提取工藝。

3.2 《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版［3］及相關(guān)文獻(xiàn)［1-2］中，芍藥苷的測(cè)定波長(zhǎng)均為230 nm，故本實(shí)驗(yàn)采用230 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.3 干浸膏得率對(duì)藥效與制劑工藝有一定的影響，故選擇總固體得率和處方中所含主要成分為提取工藝的綜合指標(biāo)。

3.4 處方原總量 472.1 g，共制 1000 mL，服用劑量每次25 mL，每天3次。由于總量較大，故試驗(yàn)時(shí)取1／4量，定量到 250 mL。

［1］趙慧萍.通脈合劑的制備及質(zhì)量控制［J］.中藥材，2008，31（12）：1913-1914.

［2］王志萍，韋慧鮮，申文慧.腦血栓片中芍藥苷的定性定量測(cè)定［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（12）：2411-2412.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：96-97.

［4］王凌，徐玲玲，符德玉.丹蛭合劑提取工藝研究［J］.中成藥，2008，30（7）：1064-1065.