鎳(Ⅱ)配合物與DNA相互作用的研究*

胡喜蘭，路 靜，陸丹丹，施鵬飛，張珍明

(1淮海工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇連云港222005;2淮海工學(xué)院江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇連云港222005)

苯妥英(5，5-Diphenylhydantion，簡寫為 Hpht)是治療癲癇病的首選藥物。作為生物配體，苯妥英是以N和O原子為配位原子，與過渡金屬形成的配合物有著豐富的立體結(jié)構(gòu)和生物活性［1-3］。鎳是生命科學(xué)中極為重要的生命元素，是生物體內(nèi)必需的痕量元素，在氫酶、甲基輔酶M還原酶、一氧化碳脫氫酶、超氧歧化酶和尿酶中均發(fā)現(xiàn)其活性中心含有鎳離子［4-6］。因此，模擬合成生命體系中過渡金屬與苯妥英配體形成的配合物對(duì)其結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行研究，對(duì)揭示金屬酶的結(jié)構(gòu)，開發(fā)療效高、活性強(qiáng)、毒性小的新藥具有重要的意義［7-10］。為此我們利用水熱法，以苯妥英及1，2-丙二胺為配體與醋酸鎳反應(yīng)，合成得到了一個(gè)新穎的三元鎳配合物［Ni(pht)2(pn)2］［11］，利用電子吸收光譜法、溴化乙錠熒光分析法以及粘度測(cè)定研究了此種配合物與DNA的相互作用，為進(jìn)一步的研究打下了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

配合物的元素分析由Perkin Elmer2400型元素分析儀測(cè)定;配合物的紅外光譜由WGH-30/6型雙光束紅外分光光度計(jì)(KBr壓片)測(cè)定;島津UV-2550型紫外可見分光光度計(jì);日立F4500型熒光光譜儀，激發(fā)波長為525nm，掃描速度15nm·s-1，在220nm～900nm測(cè)量發(fā)射熒光光譜。小牛胸腺(CT-DNA，生化試劑，sigma公司);三羥甲基氨基甲烷(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠);溴化乙錠(EB，生化試劑，F(xiàn)luka公司);醋酸鎳、1，2- 丙二胺、苯妥英、無水乙醇等均為分析純?cè)噭?實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 配合物的合成及表征

配合物按文獻(xiàn)［11］進(jìn)行合成，得到淡紫色的塊狀晶體，其熔點(diǎn)大于573K;產(chǎn)物按C36H42N8NiO4計(jì)算的理論值(%):C 60.94，H 5.97，N 15.79;元素分析的測(cè)定值(%):C 61.56，H 6.09，N 16.46。IR(KBr壓片，cm-1):3346，3178，2960，2876，1629，1493，1450，1263，1122，961，759，698，603，533。該晶體幾乎不溶于水、醇，稍溶于二甲基甲酰胺(DMF)。性質(zhì)測(cè)定中配合物用少量DMF溶解后用Tris緩沖溶液定容至一定體積，備用。

1.3 配合物與DNA作用的紫外吸收光譜研究

分別往樣品池與參比池中加入2mL Tris-HCl緩沖溶液 (CTris=50mmol·L-1，CNaCl=10mmol·L-1，pH=7.42)，進(jìn)行基線掃描，然后用2mL的DNA溶液取代樣品池的緩沖溶液進(jìn)行掃描，再依次往樣品池和參比池中加入一定體積的配合物，每加一次掃描一次。

1.4 配合物對(duì)EB-DNA體系熒光強(qiáng)度的影響

在溶液中，EB(ethidium bromide)能平行的插入到雙螺旋DNA結(jié)構(gòu)的堿基之間而產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。然而，當(dāng)EB被其他能插入到DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的分子擠出來時(shí)，整個(gè)體系的熒光顯著降低，因此可通過測(cè)定配合物對(duì)EB-DNA體系的熒光光譜的影響來研究配合物與DNA的作用。在EB-DNA體系(CEB/CDNA=0.5)中，每次加入一定體積的的配合物，以525nm為激發(fā)波長，在550nm～650nm波長區(qū)間記錄每次配合物對(duì)EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度變化。

1.5 配合物與DNA作用的粘度測(cè)定

粘度測(cè)量時(shí)，將溫度恒定在(25±0.1)℃進(jìn)行。測(cè)試液相對(duì)粘度按下列公式計(jì)算:η=(t-t0)/t0，其中t0為緩沖液流經(jīng)毛細(xì)管所需的時(shí)間，t為DNA溶液(含濃度不等的配合物)流經(jīng)毛細(xì)管所需的時(shí)間，η0為未加配合物時(shí)DNA溶液的相對(duì)粘度，以(η/η0)1/3對(duì)結(jié)合比率 r(r=CComplex/CDNA)作圖，可以看到鎳配合物對(duì)DNA粘度的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜表征

該配合物的紅外光譜中在3346cm-1、3178cm-1附近的吸收峰為1，2-丙二胺上的N-H鍵上的N-H鍵伸縮振動(dòng)吸收，在2960cm-1及2876cm-1分別為甲基和亞甲基的吸收，1629cm-1可以確認(rèn)為苯妥英咪唑環(huán)上的羰基吸收峰，與配體苯妥英咪唑環(huán)上的羰基吸收峰相比較，藍(lán)移了 90cm-1，1493cm-1、1450cm-1為苯環(huán)的骨架振動(dòng)，1263cm-1為C-N的伸縮振動(dòng)，1122cm-1、961cm-1是苯環(huán)的C-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)，759cm-1、698cm-1為苯環(huán)C-H的面外彎曲振動(dòng)，603cm-1、533cm-1的弱雙峰可確認(rèn)為 Ni-NH2和Ni-N鍵的伸縮振動(dòng)，而在配體苯妥英紅外光譜中沒有此吸收，進(jìn)一步說明了鎳離子與氨基、苯妥英咪唑環(huán)上的氮原子形成了配位鍵。

2.2 配合物與CT-DNA作用的紫外光譜

從圖1中可以發(fā)現(xiàn)在260nm左右，CT-DNA在反應(yīng)前有一較強(qiáng)的吸收峰，這是典型的DNA分子中堿基的紫外吸收，配合物在此也有吸收，CT-DNA與該配合物反應(yīng)之后(如圖1)，呈現(xiàn)了較明顯的減色效應(yīng)，當(dāng)加入 440μL配合物(r=CComplex/CDNA=1.78)時(shí)，其減色率達(dá)到了8.56%，這可能是由于配合物插入到DNA堿基之間，配體的空π軌道與DNA堿基填有電子的π軌道發(fā)生耦合，使π→π*軌的能量下降導(dǎo)致躍遷幾率減小而產(chǎn)生減色效應(yīng)，可認(rèn)為是配合物與DNA之間存在一種插入作用［12-15］。

圖1 DNA在不同配合物濃度作用下的電子吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of the DNA upon addition of the complex:1.0 ×10 －4mmol·L －1CT-DNA.r=0，0.32，0.81，1.78，2.75

2.3 配合物與EB-DNA體系的熒光光譜

從圖2中其中可以看出在EB-DNA體系中隨著配合物濃度的增大，即r(r=Ccomplex/CDNA)值的增大，EB-DNA的熒光強(qiáng)度逐步被猝滅，說明配合物與DNA作用后，將EB從EB-DNA復(fù)合物中擠出，由此推測(cè)配合物中的苯妥英配體可能與DNA發(fā)生了部分插入作用。圖3中I0為EB-DNA的熒光強(qiáng)度，I為加入配合物后EB-DNA的熒光強(qiáng)度，從圖3中可以看出當(dāng)r＞3.3時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度減弱為50%，說明該配合物與DNA發(fā)生了插入結(jié)合作用［12-14］，這與紫外吸收光譜分析所得的結(jié)果是一致的。

圖2 配合物對(duì)EB-DNA體系的熒光光譜的影響Fig.2 Effects of the complex on the fluorescence spectra of EB-DNA system From top to bottom show the absorbance changing upon the increase in complex concentration，r:(0)0.79，(1)1.58，(2)2.37，(3)3.16，(4)3.95，(5)4.74，(6)5.53，(7)6.32，(8)7.11

圖3 配合物對(duì)EB-DNA體系的熒光猝滅Fig.3 Emission quenching of the complex to the EBDNA system plots of I0/I vs r for the titration of DNA with the complex;r:(0)0.79，(1)1.58，(2)2.37，(3)3.16，(4)3.95，(5)4.74，(6)5.53，(7)6.32，(8)7.11

2.4 配合物與DNA作用的粘度分析

粘度法一般認(rèn)為是檢測(cè)配合物與DNA結(jié)合方式的重要依據(jù)之一。從配合物與DNA作用的粘度(圖4)判斷該配合物是以插入方式與DNA相互作用的［12-14］。這一結(jié)果也與前面的紫外吸收光譜和熒光分析的結(jié)果相一致，進(jìn)一步說明該配合物與DNA發(fā)生了插入結(jié)合作用。

圖4 DNA相對(duì)粘度隨配合物加入量的變化Fig.4 Effects of increasing amounts of the complex on the relative viscosity of DNA

3 結(jié)論

三元配合物［Ni(pht)2(pn)2］可能是以插入方式與小牛胸腺DNA結(jié)合的。

［1］Nokhodchi A，Bolourtchian N，Dinarvand R.Crystal Modification of Phenytoin Using Different Solvents and Crystallization Conditions［J］.Pharmaceutics，2003，250:85-97.

［2］Muhrer G，Meier U，F(xiàn)usaro F，et al.Use of Compressed Gas Precipitation to Enhance the Dissolution Behavior of a Poorly Water-soluble Drug:Generation of Drug Microparticles and Drug-polymer Solid Dispersions［J］.Inter.J.Pharmaceutics，2006，308:69-83.

［3］Milne P，H? M，Weaver D F.Interaction of Anticonvulsant Drugs with Metals:a Semi-empirical Molecular Orbital Study of Phenytoin-zinc(Ⅱ)Complexation［J］.Journal of Molecular Structure，1999，492:19-28.

［4］LU Z，CRABTREE R H.A Functional Modelling Study of the CO Oxidation Site of Nickel CO Dehydrogenase［J］.J.Am.Chem.Soc，1995，117:3994-3998.

［5］DIXON N E，GAZZOLA C，BLAKELEY R L，et al.Jack bean urease(EC3，5，1，5)Metalloenzyme;Simple biological role for nickel［J］.J.Am.Chem.Soc，1975，97:4131-4133.

［6］陳小華，劉世雄.［Ni(en)3］2+·H2dsh2-的合成和晶體結(jié)構(gòu)［J］.結(jié)構(gòu)化學(xué)，2004，23(6):587-590.

［7］Hu Xi-Lan，Xu Xing-You，Xu T T，et al.(5，5-diphenylhydantoinato-кN3)［trisi(3-aminoprepyl)amine］copper(Ⅱ)5，5-diphenylhydantoinate Methanol Solvate［J］.Acta Cryst，2006，E62:m2352-2353.

［8］Hu X L，Xu X Y，Xu T T，et al.Synthesis and Crystal Structure of A New Dinuclear Cu(Ⅱ)［J］.Synth.React.Inorg.Metal-Org，2006，36:701-704.

［9］胡喜蘭，許興友，尹福軍，等.Synthesis，Crystal Structure and Antimicrobial Study of a New Copper(Ⅱ)Complex［J］. 人工晶體學(xué)報(bào)，2008，37(6):1562-1566.

［10］胡喜蘭，施鵬飛，許興友，等.雙核銅配合物［Cu(pht)2(ba)2］2的合成、晶體結(jié)構(gòu)和抑菌活性［J］. 人工晶體學(xué)報(bào)，2009，38(5):1285-1289.

［11］Hu Xi-Lan，Xu Xing-You，Yin Fu-Jun，et al.trans-Bis(5，5-Diphenylhydantoinato-N3)Bis(1，2-propanediamine))Nickel(Ⅱ)［J］.Acta Cryst，2008，E64:m1636.

［12］楊頻，高飛.生物無機(jī)化學(xué)原理［M］.北京:科學(xué)出版社，2002.

［13］胡喜蘭，施鵬飛，許興友，等.三核銅(Ⅰ/Ⅱ)配合物［Cu(en)2］［Cu(pht)2］2的合成、晶體結(jié)構(gòu)及與DNA相互作用的研究［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2009，67(21):2517-2522.

［14］胡喜蘭，施鵬飛，許興友，等.混價(jià)四核銅(Ⅰ/Ⅱ)配合物［Cu2L2］［Cu(pht)2］2的合成、晶體結(jié)構(gòu)及性質(zhì)研究［J］. 化學(xué)學(xué)報(bào)，2009，68(6):487-492.