鉛鎘重金屬與生殖內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激研究進展

劉康生，顧平清，鐘天鷹綜述，陳文軍審校

近年來發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ndoplasmic reticulum stress，ERS)是區(qū)別于線粒體途徑且能獨立導(dǎo)致細胞凋亡的一條新的通路。缺氧、缺血再灌注損傷、病毒感染等均可引發(fā)ERS。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有很強的保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的能力，ERS一旦發(fā)生就會立即激活自我調(diào)整的信號反應(yīng)機制，以期恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。ERS被普遍認為是細胞早期適應(yīng)性反應(yīng)。當(dāng)ERS時間過久時，細胞代償機制由凋亡機制取代，細胞進入凋亡［1］。重金屬(鉛)能導(dǎo)致多器官、系統(tǒng)、組織及細胞產(chǎn)生病理變化，鉛損傷除了對神經(jīng)行為［2］和免疫系統(tǒng)發(fā)生影響之外［3］，生殖系統(tǒng)也是鉛作用的靶器官之一，近幾年伴隨不孕不育人數(shù)的激增，與環(huán)境中重金屬影響如鉛暴露不無關(guān)系［4］。

目前研究發(fā)現(xiàn)，ERS與一些疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，心血管疾病、腫瘤等疾病的發(fā)生，均與ERS誘導(dǎo)的凋亡有關(guān)［5-6］。因此，關(guān)于ERS與凋亡的關(guān)系研究備受關(guān)注，但與人類和動物生殖系統(tǒng)的研究還相對較少，本文就近幾年來的進展綜述如下。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)未折疊蛋白反應(yīng)信號通路組成和調(diào)控機理

目前研究認為，未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)通過上調(diào)分子伴侶蛋白、激活細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解通路和抑制蛋白翻譯來緩解ERS。若ERS過于劇烈，UPR將直接引發(fā)程序性死亡。UPR信號通路主要由一個分子伴侶蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78/Bip和三個感受蛋白肌醇酶I(IRE1)、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)、轉(zhuǎn)錄激活因子6(ATF6)介導(dǎo)的信號通路組成(圖1)［7］。

圖1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR信號通路流程圖

其中IRE1普遍存在于酵母和哺乳動物細胞中，具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性，而PERK和ATF6則只存在于哺乳動物細胞。在哺乳動物細胞中，IRE1a信號通路在UPR引起細胞保護性機制與細胞凋亡之間的轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要的作用，其介導(dǎo)的X-盒結(jié)合蛋白1(XBP-1)剪接誘導(dǎo)的UPR能夠促進細胞的生存，但激活的IRE1a、胞漿的酶結(jié)構(gòu)域招募接頭分子，與凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)共同形成IRE1-TRAF2-ASK1復(fù)合物，從而激活氨基末端激酶(C-jun N-terminal kinase，JNK)［8-9］。近來研究表明，JNK可以阻止或促進細胞死亡，這取決于強度激活的時間。持續(xù)活化PERK通路可誘導(dǎo)C/EBP同源蛋白(CHOP)的積聚，促使細胞死亡。在一些細胞中，CHOP直接誘導(dǎo)Bcl蛋白家族凋亡成員BIM的轉(zhuǎn)錄。PERK-CHOP-BIM信號軸可以使連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的錯誤折疊的凋亡機制激活。在UPR中，ATF6不同于IRE1和PERK的調(diào)控途徑，ATF6是ATF/CREB(cAMP response-element-binding)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是通過外殼蛋白復(fù)合物Ⅱ(COPⅡ)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運到高爾基體內(nèi)。ATF6與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白(BIP)結(jié)合停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。在ERS狀態(tài)下，ATF6會減少，但具體進展還需進一步研究。ATF6信號通路調(diào)控涉及一個被稱為調(diào)節(jié)膜內(nèi)蛋白水解(RIP)的機制(蛋白質(zhì)到高爾基體內(nèi)的水解過程)。在經(jīng)歷轉(zhuǎn)運后，其活化的N端轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)并誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶、X盒結(jié)合蛋白1(XBP1CHOP)等的轉(zhuǎn)錄表達［10］。

Caspase-12是半胱天冬酶家族中唯一僅在ERS通路中活化定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子，普遍認為Caspase-12是 ERS的特異性凋亡分子［11］。在沒發(fā)生ERS時，Caspase-12以無活性酶原狀態(tài)分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。當(dāng)發(fā)生ERS時，IRE1α激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子TRAF2并將Caspase-12剪切活化，進而激活Caspase家族的其他信號蛋白，引起經(jīng)典Caspase途徑介導(dǎo)的細胞凋亡［12］。由于人體細胞缺乏Caspase-12基因(基因突變)，其介導(dǎo)細胞凋亡作用被為同源物的Caspase-4替代，并對ERS反應(yīng)是特異性的［13-14］。通常情況下，GRP78與 Caspase-12以復(fù)合體存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，一定程度上抑制了細胞凋亡，但當(dāng)ERS發(fā)生時，GRP78的解離使Caspase-12活化進而引發(fā)細胞凋亡的激活，形成相應(yīng)的特異性蛋白。Wu等［15］在食管癌細胞 EC109中首次證實，腺甘可通過CHOP和Caspase-4通路誘導(dǎo)癌細胞凋亡。

2 ERS與生殖相關(guān)通路研究

Xu等［16］在小鼠孕第8天腹腔注射200個RH速殖子，感染小鼠在孕14天后開始出現(xiàn)感染癥狀，但是多數(shù)在孕16 d仍然存活。通過熒光定量PCR和蛋白免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)了感染組中，ERS標(biāo)記物，如 GRP78，CHOP 和 Caspase-12，JNK/ASK1 信號上調(diào)或激活，而以NAC預(yù)處理可抑制上述基因的表達或信號通路的激活。2011年烏蘭等［17］探討了胎盤組織中 ERS相關(guān)蛋白——鈣聯(lián)蛋白(calnexin，CNX)mRNA及蛋白表達與子癇前期發(fā)病的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)輕重度子癇前期患者組CNX mRNA表達水平高于正常足月妊娠組［分別為(1.32±0.06)、(3.42±0.11)與(0.54±0.04)］，并且 CNX蛋白表達水平也高于正常足月妊娠組［分別為(1.57±0.23)、(2.11±0.53)與(0.57±0.11)］，提示了 ERS可能是子癇前期發(fā)病機制之一。有文獻［18］探討了ERS介導(dǎo)的細胞凋亡在子宮內(nèi)膜異位癥(EM)發(fā)病中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EM患者異位和在位子宮內(nèi)膜細胞凋亡率均顯著低于正常子宮內(nèi)膜，且異位子宮內(nèi)膜細胞凋亡率顯著低于在位子宮內(nèi)膜;EM患者異位和在位子宮內(nèi)膜 GRP78和 GRP94，Caspase-3，12 mRNA及蛋白表達水平均顯著低于正常子宮內(nèi)膜，異位子宮內(nèi)膜 GRP78和GRP94，Caspase-12，3 mRNA及蛋白表達水平亦顯著低于在位子宮內(nèi)膜，認為EM患者子宮內(nèi)膜細胞凋亡減少，ERS介導(dǎo)的細胞凋亡途徑下調(diào)可能是EM發(fā)病的機制之一。

子癇前期中，miRNA-101可通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp44的表達來調(diào)控胎盤滋養(yǎng)細胞的凋亡過程［19］。在HTR-8/SVneo(滋養(yǎng)細胞)中過表達miRNA-101后，ERp44的表達顯著下調(diào)，封閉 miRNA-101后，細胞凋亡數(shù)量增加。各種生理和病理學(xué)條件導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)的積累，會引發(fā)ERS。通過RNA深度測序，發(fā)現(xiàn)ERS脅迫下，HeLa細胞中hsa-miR-423-5p的表達上調(diào)，而hsa-miR-452-5p的表達下調(diào)，以Western blotting實驗證實CDKN1A是hsa-miR-423-5p的靶基因，推測microRNA通過調(diào)控它們的靶基因，在ERS的適應(yīng)性反應(yīng)中協(xié)同作用［20］。

3 鉛與生殖ERS的相關(guān)研究

3.1 睪丸間質(zhì)細胞 睪酮激素的主要來源于睪丸間質(zhì)細胞，睪酮水平取決于細胞本身的反應(yīng)。有研究［21］顯示ERS特異誘導(dǎo)劑胡蘿卜素和衣霉素顯著誘導(dǎo)了小鼠睪丸間質(zhì)細胞的凋亡，且呈濃度和時間依賴性。GRP78 mRNA的表達水平在培養(yǎng)24 h顯著上升，48 h呈下降趨勢。CHOP和Caspase-12 mRNA的表達水平隨凋亡率的增加顯著上升。ERS通過CHOP Caspase-12信號通路參與小鼠睪丸間質(zhì)細胞的凋亡過程［22］。鉛鎘也可以在不同細胞類型中誘發(fā)ERS，可以上調(diào)小鼠睪丸細胞GRP78等ERS相關(guān)蛋白，并上調(diào)CHOP的表達并激活Caspase-12，從而導(dǎo)致系膜細胞凋亡。

3.2 胚胎細胞。細胞凋亡是鉛致胎盤損傷的重要機制之一。Smad4及S100B蛋白在孕期不同階段于鉛暴露下大鼠胎盤中的表達與孕末期血鉛水平密切相關(guān)，在鉛致胎盤細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［23］。王云英等［24］認為血鉛水平與胎盤組織中NF-KB表達和細胞凋亡指數(shù)顯著相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為0.663和0.641)，鉛暴露引起NF-KB表達異?？赡苁翘ケP細胞失衡和胚胎發(fā)育異常的重要機理之一。斑馬魚由于具有成熟周期短，繁殖率高、傳代周期短、產(chǎn)卵時間長、胚胎透明以及魚種發(fā)育遺傳背景清晰等優(yōu)點，非常適用于鉛的生殖毒性等遠期效應(yīng)的觀察，2014年殷?。?5］研究重金屬鉛對斑馬魚成魚和胚胎的影響，發(fā)現(xiàn)鉛會引起斑馬魚胚胎心率減慢，體長減小，鉛對斑馬魚成魚和胚胎氧化應(yīng)激、細胞凋亡的發(fā)生、毒性作用機制均與絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。

3.3 卵巢 鉛蓄積于卵巢可使皮質(zhì)區(qū)變薄，成熟卵泡、生長卵泡減少，卵泡內(nèi)上皮細胞核固縮、線粒體腫脹、崩解等。鉛可抑制卵母細胞第一極體的釋放，影響卵母細胞的存活率并可降低體外受精率和卵母細胞數(shù)量;亦破壞卵母細胞減數(shù)分裂進行，降低卵母細胞的受精能力，影響小鼠的正常生殖功能［26］。尹嬌嬌［27］研究表明，ERS參與了山羊顆粒細胞凋亡進程，表皮生長因子(EGF)通過下調(diào) ATF4、ATF6、CHOP mRNA水平的表達，對ERS誘導(dǎo)的山羊顆粒細胞凋亡具有顯著的抑制作用。

3.4 衣霉素(TM)誘導(dǎo)卵巢和胚胎ERS實驗 衣霉素可通過影響蛋白質(zhì)的糖基化，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未成熟蛋白堆積而誘發(fā)ERS。丁曉等［28］以TM誘導(dǎo)卵巢ERS，以卵巢玻璃化凍存流程中前培養(yǎng)1 h作為參考，對ERS伴侶蛋白GRP78表達水平進行檢測，顯示各濃度 TM誘導(dǎo)的卵巢GRP78表達均高于對照組，以TM達5 μg/mL時響影最為顯著，隨后隨著濃度增加表達逐漸穩(wěn)定并略有下降;而對作用3 h后CHOP表達檢測顯示，隨著 TM濃度的增加，CHOP緩慢上升并與10、20和30 μg/mL組持續(xù)高濃度表達，說明在保護因子無法緩解ERS時，CHOP上升介導(dǎo)細胞走向凋亡。李昕昕等［29］利用TM處理胚胎激發(fā)ERS，應(yīng)用顯微注射mRNA方法實現(xiàn)基因過表達，通過注射特異的反義寡核苷酸實現(xiàn)基因封閉，發(fā)現(xiàn)XBP1剪切隨IRE1a過表達及封閉而增加或減少，以TM處理導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形，XBP1剪切增加，而封閉XBP1可部分挽救發(fā)育畸形;封閉IRE1a亦可明顯挽救發(fā)育畸形，XBP1剪切恢復(fù)，但具體作用機制需進一步研究。

3.5 其他 有研究［30］表明，鉛暴露組ERS使凋亡Caspase-12 mRNA蛋白表達增加，凋亡指數(shù)(AI)在實驗組明顯上升。鉛暴露組中胎盤滋養(yǎng)層細胞發(fā)生纖維蛋白沉積，線粒體腫脹，數(shù)量減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，空泡形成，同時使胎盤細胞發(fā)生凋亡，增加Caspase-12 mRNA表達，促進了ERS。

4 鎘與生殖ERS的相關(guān)研究

4.1 睪丸間質(zhì)細胞、胚胎細胞 Lian等［31］的文獻研究表明，胎盤發(fā)育損傷和胎兒生長發(fā)育遲緩與胎盤ERS有關(guān)。有研究［25］闡述重金屬鎘對斑馬魚成魚和胚胎的96 h半數(shù)致死濃度(96 h-LC50)分別為24.341 mg/L和46.67 mg/L，而胚胎孵育抑制作用的96 h半數(shù)致畸濃度(96 h-EC50)為42.499 mg/L。重金屬鎘引起斑馬魚胚胎心率減慢，體長減小;鎘對斑馬魚成魚和胚胎均具有明顯的毒性作用，能夠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、細胞凋亡及免疫毒性的發(fā)生，其毒性作用機制與 MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)［32］。Wang等［33］發(fā)現(xiàn)，孕期母體鎘暴露明顯升高窩胎鼠指(趾)部和尾部畸形率，顯著降低胎鼠身長、活胎重和胎盤重，胎盤迷路層的平均血竇區(qū)域明顯減少。以鎘處理的小鼠胎盤迷路層增殖細胞核抗原(PCNA)陽性增殖細胞數(shù)較對照組明顯減少，TUNEL(TdT介導(dǎo)dUTP缺口末端標(biāo)記)陽性細胞數(shù)亦較對照組顯著増多，孕期母體以鎘處理 8 h后，小鼠胎盤組織GRP78和ATF4 mRNA水平明顯升高，且胎盤組織GRP78、peIF2α和CHOP蛋白表達顯著上調(diào)，提示孕期鎘暴露會顯著誘導(dǎo)小鼠胎盤ERS。

4.2 卵巢 有文獻［34］探討了鎘對卵巢細胞凋亡的誘導(dǎo)作用，病理檢測可見隨鎘劑量的增加，卵泡閉鎖率逐漸升高，與對照組相比差異明顯;96 h對照組凋亡率上升為10.20%，而高、中、低各組分別為21.41% 、15.88%、12.47%，表明各組均有不同程度凋亡。鎘對小鼠卵巢顆粒細胞的凋亡具有促進作用并有劑量的效應(yīng)關(guān)系，鎘對卵巢卵泡的發(fā)育有促進閉鎖的作用，增加了閉鎖卵泡構(gòu)成比;同時鎘能使小鼠卵巢顆粒細胞中的丙二醛(MDA)增加和超氧化物歧化酶(SOD)活性的降低，鎘增強卵巢顆粒細胞p53蛋白的表達，p53基因參與了小鼠卵巢顆粒細胞凋亡的調(diào)控。

5 討論和展望

本文對ERS與生殖疾病及鉛鎘重金屬與生殖ERS的相關(guān)進行描述。一方面，鉛鎘誘導(dǎo)ERS有其共同特點，在劑量與效應(yīng)關(guān)系或者時間與效應(yīng)關(guān)系都呈先上升后下降的方向;另一方面，ERS引起的程序性死亡機制是通過CHOP和Caspase-12等介導(dǎo)的。目前對于ERS受鉛鎘影響機制研究以體外動物研究為主，選擇鉛鎘的靶器官或靶細胞進行相關(guān)的體內(nèi)研究很少，值得進一步深入探討。

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