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    3種顯色反應(yīng)對(duì)稻米籽粒中原花色素含量的檢測(cè)分析

    2015-12-08 05:26:42劉麗莉白寧寧嚴(yán)明理
    關(guān)鍵詞:香草醛花色素染色法

    劉麗莉,白寧寧,謝 婧,嚴(yán)明理

    (1. 湖南科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,湖南 湘潭 411201;2. 湖南科技大學(xué) 重金屬污染土壤生態(tài)修復(fù)與安全利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 湘潭 411201)

    3種顯色反應(yīng)對(duì)稻米籽粒中原花色素含量的檢測(cè)分析

    劉麗莉1,2,白寧寧1,謝 婧1,嚴(yán)明理1,2

    (1. 湖南科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,湖南 湘潭 411201;2. 湖南科技大學(xué) 重金屬污染土壤生態(tài)修復(fù)與安全利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 湘潭 411201)

    利用二甲基乙酰胺二甲基縮醛(DMACA)染色法、鐵銨礬染色法和香草醛染色法,測(cè)定了不同品種稻米籽粒中原花色素的含量。用DMACA染色法測(cè)得譚農(nóng)s/制21、R288、凡-14、12庚351、秦稻2號(hào)籽粒中原花色素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0.136, 0.183, 0.085, 4.115, 24.736 mg/g;用鐵銨礬染色法測(cè)得的質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0.292, 0.094, 1.940×10-4, 1.220, 8.080 mg/g;用香草醛染色法測(cè)得的質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為1.349, 1.363, 1.093, 3.733, 15.153 mg/g。檢測(cè)結(jié)果表明:5種稻米品種中,秦稻2號(hào)的原花色素含量最高,是12庚351的4.1~6.6倍,凡-14中的含量最低;黑米品種(秦稻2號(hào)和12庚351)比白米品種(R288、譚農(nóng)s/制21和凡-14)中原花色素的含量明顯要高。吸光度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值表明,3種染色法測(cè)定原花色素含量的精密度由高到低依次為:香草醛染色法、DMACA染色法、鐵銨礬染色法。

    稻米;原花色素;顯色反應(yīng);DMACA染色法;鐵銨礬染色法;香草醛染色法

    0 引言

    原花色素(proanthocyanidins,PCs)是一類廣泛存在于各種植物中的具有特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮,由不同數(shù)量的兒茶素(catechin)或表兒茶素(epicatechin)結(jié)合而成[1]。最簡單的原花色素是兒茶素和表兒茶素單體兩者形成的二聚體,此外還有三聚體、四聚體等至十聚體。這類物質(zhì)共同的特點(diǎn)是在酸性介質(zhì)中加熱均可產(chǎn)生花色素,故被稱為原花色素[2]。原花色素是迄今發(fā)現(xiàn)的植物源最高效的抗氧化劑之一,能有效清除活性氧自由基,并抑制脂質(zhì)過氧化。研究表明,原花色素的抗氧化能力是維生素E的5倍,維生素C的2倍,并在機(jī)體內(nèi)迅速吸收完全[3-4]。原花色素在許多植物花和果實(shí)的色素形成過程中發(fā)揮重要作用[5-7]。目前對(duì)于植物原花色素的測(cè)定方法較多,如可見分光光度法、高效液相色譜法、液-質(zhì)譜聯(lián)用法、化學(xué)發(fā)光法等[8-9]。植物組織前處理的方法對(duì)于樣本測(cè)定分析十分重要,原花色素是天然的植物多酚類化合物,因成分復(fù)雜,不同植物組織其前處理方法也存在差異。正丁醇-鹽酸法[10]對(duì)測(cè)定的選擇性較高,多受多酚結(jié)構(gòu)的影響;鐵鹽催化染色法[11]對(duì)測(cè)定原花色素的顯色反應(yīng)特征明顯,操作簡便,但重現(xiàn)性較差;香草醛法[12]對(duì)多酚縮合單寧的選擇性不太理想,可是對(duì)葡萄籽、梗中原花色素的顯色反應(yīng)靈敏度高,效果較穩(wěn)定[13]。

    目前,國內(nèi)外有關(guān)原花色素的研究對(duì)象大多集中于葡萄籽、海岸松、山楂、小麥和油菜籽中,而稻米中原花色素的檢測(cè)研究則較少報(bào)道。本文利用二甲基乙酰胺二甲基縮醛(DMACA)染色法、鐵銨礬(H4FeNO8S·12H2O)染色法、香草醛染色法3種顯色反應(yīng)研究不同顏色的稻米籽粒中原花色素測(cè)定的前處理方法,使稻米中原花色素與染色劑反應(yīng)顯色,通過紫外-可見分光光度法測(cè)定其原花色素的吸光值,并比較分析以白、黑米為代表的稻米籽粒中原花色素的相對(duì)含量,以期為高原花色素含量的水稻品種選育和稻種資源開發(fā)提供參考。

    1 試驗(yàn)部分

    1.1 試驗(yàn)樣品、試劑和儀器

    1)試驗(yàn)樣品:譚農(nóng)s/制21、R288、凡-14、12庚351和秦稻2號(hào)5個(gè)水稻品種,均為去殼的稻米籽粒,研磨成粉末,干燥通風(fēng)保存。

    2)試驗(yàn)試劑:原花色素標(biāo)準(zhǔn)品,南京替斯艾么中藥研究所;二甲基乙酰胺二甲基縮醛、香草醛,德國Sigma公司;鐵銨礬(H4FeNO8S·12H2O),長沙市邁科為生物科技有限公司;正丁醇(BuOH)、鹽酸,均為分析純,湖南匯虹試劑有限公司;無水乙醇,分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 甲醇,分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

    3)試驗(yàn)儀器:UV756CRT紫外-可見分光光度計(jì),上海佑科儀器儀表有限公司;AUY220型電子分析天平,日本島津公司;5417R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),德國Eppendorf公司;DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SC-15C型數(shù)控超級(jí)恒溫槽,寧波天恒儀器廠;BCD-254型冷藏冷凍冰箱,博西華兼用電器有限公司;制冰機(jī),瑞安市康德嘉利機(jī)械設(shè)備制造廠;DSC-W310型數(shù)碼相機(jī),索尼有限公司。

    1.2 顯色劑配制

    1) DMACA染色試劑:25 mL 濃度為12 mol/L的HCl與25 mL蒸餾水混溶后,加入0.1 g DMACA溶解,再加入50 mL 95%的乙醇完全溶解,置于4 ℃保存。

    2)鐵銨礬染色試劑:2.5 mL 濃度為12 mol/L的HCl與12.5 mL蒸餾水混溶后,加入0.3 g鐵銨礬溶解,置于4 ℃保存;

    3)正丁醇-鹽酸試劑:95 mL正丁醇與5 mL 濃度為12 mol/L的 HCl混合即可,4℃保存。

    4)香草醛染色試劑:50 mL無水乙醇與50 mL 濃度為12 mol/L的HCl混合后,加入0.3 g香草醛完全溶解后,置棕色試劑瓶中于4 ℃避光保存。

    1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和測(cè)定方法

    1)DMACA顯色法:稱取0.1 g稻米粉末樣品,置于試管中,并加入1.0 mL DMACA染色試劑,30 ℃下水浴2 h,再移至1.5 mL離心管中,在4 500 r/min 、4℃下離心1 min后,取上清液,以染色液作空白對(duì)照,測(cè)定其在max處的吸光度。

    2)鐵銨礬顯色法:稱取0.1 g樣品,置于試管中并加入3.0 mL 正丁醇-鹽酸試劑,再加入0.10 mL鐵銨礬染色劑,沸水浴處理15 min后(水浴8 min時(shí)適當(dāng)混勻反應(yīng)液),冰水浴15 min,冷卻至室溫后移至1.5 mL離心管中;然后在4 500 r/min、4 ℃下離心1 min,取上清液,以染色液作空白對(duì)照,測(cè)定其在max處的吸光度。

    3)香草醛顯色法:稱取0.1 g樣品,置于試管中,加入3.0 mL香草醛試劑混勻,30 ℃恒溫水浴下顯色2 h;然后移至1.5 mL離心管中,在4 500 r/min、4 ℃下離心1 min,取上清液,用香草醛染色劑稀釋2.5倍后,以染色液作空白對(duì)照,測(cè)定其在max處的吸光度。

    1.4 精密度試驗(yàn)

    取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,按1.3中試驗(yàn)方法操作,重復(fù)5次,利用SPSS 7.0軟件對(duì)各數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理,并以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)對(duì)測(cè)定原花色素含量的3種顯色方法的精密度進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 顯色反應(yīng)

    2.1.1 原花色素標(biāo)準(zhǔn)樣品的顯色反應(yīng)

    圖1是6種不同質(zhì)量濃度的原花色素標(biāo)準(zhǔn)樣品分別與DMACA染色劑、鐵銨礬染色劑、香草醛染色劑起顯色反應(yīng)后的顏色變化對(duì)比。由圖可以看出:原花色素與DMACA染色反應(yīng)后,顏色依次呈現(xiàn)深紫藍(lán)至淺紫藍(lán);原花色素與鐵銨礬染色反應(yīng)后,顏色則依次呈淺紅至淺黃色;原花色素與香草醛染色反應(yīng)后,顏色也依次呈紫紅色至淺紫色。

    圖1 3種方法染色后不同濃度原花色素標(biāo)準(zhǔn)樣品的顏色變化Fig. 1 The standard sample color changes of different concentration proanthocyanidins for three staining methods

    2.1.2 稻米籽粒中原花色素的顯色反應(yīng)

    將5種稻米樣品分別與DMACA、鐵銨礬、香草醛染色反應(yīng)后,觀察其提取液顏色的變化,并與空白染色液的顏色對(duì)比,結(jié)果如圖2所示。由圖可以看出:經(jīng)DMACA染色反應(yīng)后,譚農(nóng)s/制21、R288、凡-14的提取液呈淺藍(lán)色,而12庚351和秦稻2號(hào)的提取液則呈深紫色;經(jīng)鐵銨礬染色反應(yīng)后,譚農(nóng)s/制21、R288、凡-14的提取液為微黃色,而12庚351和秦稻2號(hào)的提取液為深淺程度不一的酒紅色;經(jīng)香草醛染色反應(yīng)后,譚農(nóng)s/制21、R288、凡-14的提取液略顯淺紫黑色,而12庚351和秦稻2號(hào)的提取液為酒紅色。

    圖2 稻米籽粒中原花色素的顯色反應(yīng)結(jié)果Fig. 2 Color reaction result of proanthocyanidins in rice grains

    2.2 原花色素含量的測(cè)定結(jié)果

    2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣的全波長掃描結(jié)果

    利用紫外-可見分光光度計(jì)在檢測(cè)波長為300~800 nm范圍內(nèi),對(duì)質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL原花色素標(biāo)樣進(jìn)行全波長掃描,發(fā)現(xiàn)原花色素標(biāo)樣經(jīng)DMACA、鐵銨礬、香草醛染色劑處理后的最大光吸收峰均分布在550 nm處左右,如圖3所示。故將試驗(yàn)中稻米籽粒反應(yīng)液中原花色素含量檢測(cè)的波長確定為550 nm。

    圖3 原花色素標(biāo)準(zhǔn)樣全波長掃描圖Fig. 3 Full spectrum scanning diagram for standard samples of proanthocyanidins

    2.2.2 原花色素含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    將標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)DMACA法、鐵銨礬法和香草醛法染色反應(yīng)后,得到原花色素的標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖4所示。利用最小二乘法,將原花色素的含量與吸光度進(jìn)行線性回歸分析,得到3種方法的回歸曲線方程分別為:

    由此可知,這3種染色法測(cè)定的原花色素含量與吸光度變化之間均呈良好的線性關(guān)系,故均可作為樣品中原花色素含量的測(cè)定方法。

    圖4 3種染色法測(cè)定原花色素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 4 The standard curves of determining proanthocyanidins by three staining methods

    2.2.3 稻米籽粒中原花色素含量的測(cè)定

    1)DMACA染色法。試驗(yàn)時(shí),譚農(nóng)s/制2 1、R288、凡-14和12庚351稻米籽粒的提取液均稀釋至原來的5倍。因秦稻2號(hào)提取液與DMACA染色劑所起的顯色反應(yīng)呈深紫色,不能進(jìn)入紫外-可見分光光度計(jì)的比色測(cè)試區(qū)間,故將其提取液稀釋至原來的20倍,與染色劑反應(yīng)后再進(jìn)行檢測(cè)。通過測(cè)定各樣本液與DMACA染色劑發(fā)生反應(yīng)的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(15, 30, 45 s)的吸光度。經(jīng)計(jì)算得5種稻米籽粒中原花色素含量,具體結(jié)果見表1。由表可知,原花色素含量最高的是秦稻2號(hào),12庚351次之,最低的是凡-14。

    表1 DMACA染色法對(duì)稻米樣品中原花色素含量的測(cè)定結(jié)果Table 1 The determining results of proanthocyanidins in rice samples by the DMACA staining

    2)鐵銨礬染色法。用鐵銨礬染色法測(cè)定稻米樣品反應(yīng)液時(shí),由于12庚351、秦稻2號(hào)籽粒提取液顏色較深不能進(jìn)入儀器的比色檢測(cè)區(qū)間,故先將其分別稀釋至原來的5倍和10倍后再進(jìn)行試驗(yàn)。鐵銨礬染色劑與5 種稻米籽粒提取液在3個(gè)反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的吸光度,以及經(jīng)計(jì)算得到的原花色素含量結(jié)果如表2所示。由表可知,原花色素含量最高的是秦稻2號(hào),其次是12庚351,凡-14最低。

    表2 鐵銨礬染色法對(duì)稻米樣品中原花色素含量的測(cè)定結(jié)果Table 2 The determining results of proanthocyanidins in rice samples by the Ferric ammonium alum staining

    3)香草醛染色法。用香草醛染色法測(cè)定各樣本反應(yīng)液中原花色素含量時(shí),先將5 種稻米籽粒提取液均稀釋至原來的2.5倍再進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)和計(jì)結(jié)果如表3所示。由表可知,原花色素含量最高的是秦稻2號(hào),其次是12庚351,凡-14最低。

    由表1~3中3種顯色反應(yīng)的結(jié)果表明:5種稻米品種中,秦稻2號(hào)原花色素的含量最高,是12庚351的4.1~6.6倍,凡-14中原花色素的含量最低;黑米品種(秦稻2號(hào)和12庚351)比白米品種(R288高、譚農(nóng)s/制21和凡-14)原花色素的含量明顯要高。

    表3 香草醛染色法對(duì)稻米樣品中原花色素含量的測(cè)定結(jié)果Table 3 The determining results of proanthocyanidins in rice samples by the Vanillin staining

    2.3 精密度試驗(yàn)分析

    按照1.3和1.4節(jié)中的方法,對(duì)質(zhì)量濃度為0.24 mg/ mL的原花色素標(biāo)準(zhǔn)液,5次重復(fù)測(cè)定其吸光度,且以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的精密度進(jìn)行分析,結(jié)果如表4所示。由表可知,DMACA染色法的RSD值為3.279%,鐵銨礬染色法的RSD值為6.143%,香草醛染色法的RSD值為1.959%。鐵銨礬染色法的RSD值大于5%;香草醛染色法和DMACA染色法的RSD值均小于5%,且香草醛染色法具有較低的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。由此表明,香草醛染色法用于測(cè)定原花色素含量的精密度最高,DMACA染色法次之,鐵銨礬染色法的精密度較差。

    表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果分析Table 4 The precision test result analysis

    3 結(jié)論

    1)由RSD值所反映的3種測(cè)定原花色素含量方法的精密由高到低依次是:香草醛染色法、DMACA染色法、鐵銨礬染色法,故推薦采用香草醛染色法測(cè)定原花色素的含量。采用香草醛染色法檢測(cè)得譚農(nóng)s/制21、R288、凡-14、12庚351和秦稻2號(hào)稻米籽粒中,原花色素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.349, 1.363, 1.093, 3.733, 15.153 mg/g;5種稻米籽粒中原花色素的含量比為1.234∶1.247∶1∶3.415∶13.864。

    2)用3種顯色方法測(cè)得5種稻米籽粒中原花色素的含量結(jié)果表明:黑米品種(秦稻2號(hào)和12庚351)普遍高于白米品種(R288高、譚農(nóng)s/制21和凡-14),且黑米品種秦稻2號(hào)的原花色素含量是12庚351的4.1~6.6倍。

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    (責(zé)任編輯:鄧光輝)

    Determination and Analysis of the Proanthocyanidins Content in Rice Grain Based on Three Color Reaction

    Liu Lili1,2,Bai Ningning1,Xie Jing1,Yan Mingli1,2
    (1. School of Life Science,Hunan University of Science and Technology,Xiangtan Hunan 411201,China;2. Key Laboratory of Ecological Remediation and Safe Utilization of Heavy Metal-Polluted Soils of Hunan Province Unversifies,Hunan University of Science and Technology,Xiangtan Hunan 411201,China)

    The proanthocyanidins content was determined in rice grain of different colors using dimethylaminocinnamaldehyde (DMACA) staining, Ferric ammonium alum staining and Vanillin staining. Experimental studies showed that the proanthocyanidins mass fraction of five rice breeds (Tannong s/zhi21, R288, Fan-14, 12Geng351 and Qingdao2) detected by DMACA staining was successively as follows, 0.136, 0.183, 0.085, 4.115 and 24.736 mg/g (dry weight); the result detected by Ferric ammonium alum staining was 0.292, 0.094, 1.940×10-4, 1.220 and 8.080 mg/g; and the result detected by Vanillin-HCl staining was 1.349, 1.363, 1.093, 3.733 and 15.153 mg/g. The proanthocyanidins content of Qingdao2 was the highest, which was about 4.1 to 6.6 times of 12Geng351, and Fan-14 was the lowest in five rice breeds; the proanthocyanidins content of black rice breeds (Qingdao2 and 12Geng351) was higher than that of white rice breeds (Tannong s/zhi21, R288, Fan-14). The relative standard deviation (RSD) of the absorbency showed that the precision level of determining proanthocyanidins content as follow, the first was vanillin staining, the second was DMACA staining and the third was ferric ammonium alum staining.

    rice;proanthocyanidins;color reaction;DMACA staining;ferric ammonium alum staining;vanillin staining

    Q819

    A

    1673-9833(2015)05-0096-06

    10.3969/j.issn.1673-9833.2015.05.020

    2015-08-21

    湖南省普通高等學(xué)校教學(xué)改革基金資助項(xiàng)目(湘教通[2012]401號(hào)),湖南省教育廳科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目(12C0129)

    劉麗莉(1980-),女,湖南邵東人,湖南科技大學(xué)講師,博士,主要從事生物學(xué)的教學(xué)和研究工作,E-mail:liulili276@126.com

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