煙草赤星病脅迫對不同抗性品種光合特性和滲透調(diào)節(jié)的影響

楊志曉,薛剛，丁燕芳,張小全，劉紅峰,張杰,王軼，任學(xué)良,楊鐵釗

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號 450002；

2貴州省煙草科學(xué)研究院 煙草行業(yè)煙草分子遺傳重點實驗室，貴陽市觀山湖區(qū)云潭北路 550081；

3河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，許昌市北郊徂莊 461000;

4 貴州省煙草公司貴陽市公司，貴陽市瑞金北路156號 550000;

5 貴州省煙草公司黔東南州公司天柱縣分公司,天柱縣南門路121號 556600

煙草赤星病脅迫對不同抗性品種光合特性和滲透調(diào)節(jié)的影響

楊志曉1,2,薛剛1，丁燕芳3,張小全1，劉紅峰4,張杰5,王軼2，任學(xué)良2,楊鐵釗1

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號 450002；

2貴州省煙草科學(xué)研究院 煙草行業(yè)煙草分子遺傳重點實驗室，貴陽市觀山湖區(qū)云潭北路 550081；

3河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，許昌市北郊徂莊 461000;

4 貴州省煙草公司貴陽市公司，貴陽市瑞金北路156號 550000;

5 貴州省煙草公司黔東南州公司天柱縣分公司,天柱縣南門路121號 556600

以抗煙草赤星病品種凈葉黃（JYH）和感病品種長脖黃（CBH）為材料，在盆栽試驗條件下，研究不同煙草赤星病脅迫程度（輕度脅迫、中度脅迫和重度脅迫）對光合特性和滲透調(diào)節(jié)的影響。結(jié)果顯示：⑴煙草赤星病脅迫導(dǎo)致2個品種的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量均呈下降趨勢，且JYH的降幅小于CBH。⑵JYH、CBH的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度因煙草赤星病脅迫而降低。2個品種的胞間CO2濃度、氣孔限制值變化具有明顯差異，煙草赤星病脅迫導(dǎo)致CBH的胞間CO2濃度上升，氣孔限制值則明顯下降，這與JYH在重度脅迫下的變化趨勢一致。而JYH的胞間CO2濃度在輕度、中度脅迫降低，氣孔限制值則呈上升趨勢。⑶與CBH相比，JYH在煙草赤星病脅迫下具有較高的脯氨酸和可溶性總糖含量，較低的MDA含量。研究結(jié)果表明，JYH具有較強的光合作用和滲透物質(zhì)調(diào)節(jié)能力，是對煙草赤星病脅迫具有較強抗性的生理基礎(chǔ)。

煙草；煙草赤星??；光合色素；光合作用；滲透調(diào)節(jié)

煙草赤星病[Alternaria alternata]是我國煙葉生產(chǎn)中的主要病害之一，為真菌性病害。該病具有潛育期短、流行速度快的特點，成熟期為易感病階段；在環(huán)境適宜條件下，短時間內(nèi)即可大面積發(fā)生流行。煙草赤星病主要侵染葉片，嚴(yán)重影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)。目前生產(chǎn)上藥劑預(yù)防仍是控制煙草赤星病發(fā)生流行的主要方法，而長期使用化學(xué)農(nóng)藥會導(dǎo)致病菌抗藥性增加、農(nóng)藥殘留和次要病害猖獗發(fā)生等弊病[1-3]。因此，深入研究煙草赤星病的致病機理，選育抗性較好的優(yōu)質(zhì)煙草品種是目前煙葉生產(chǎn)中亟待解決的問題。

光合作用為植物生長發(fā)育提供所需的物質(zhì)和能量，是決定產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素。一些研究發(fā)現(xiàn)，病原菌侵染能夠破壞寄主葉綠體結(jié)構(gòu)，葉綠素含量降低，導(dǎo)致光合速率明顯下降[4-5]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，病原菌抑制光合作用可能是由氣孔導(dǎo)度下降引起的[6]。而同時大量報道又表明，光合電子放氧復(fù)合體活性降低、電子傳遞速率下降等非氣孔限制因素也起著重要作用[7-8]。因此，病原菌脅迫如何影響植株內(nèi)部的生理活性進(jìn)而抑制光合作用始終是抗病育種研究的重點。

外界逆境脅迫導(dǎo)致植株產(chǎn)生過量的活性氧，破壞膜系統(tǒng)，抑制光合作用[9]。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸、可溶性總糖等的積累，能夠通過維持滲透平衡、穩(wěn)定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及保持氣孔開放等生理過程的平衡和正常代謝，從而保護(hù)植物細(xì)胞免受外界逆境脅迫的傷害[10]，這表明逆境條件下光合作用與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)有著密切聯(lián)系[11]。滲透物質(zhì)對調(diào)控干旱逆境脅迫有重要貢獻(xiàn)[12]，而抗病性是否與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)有關(guān)，目前研究報道較少。

鑒于此，將光合作用與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)結(jié)合起來研究，有助于明確煙草赤星病脅迫下煙株體內(nèi)光能利用與代謝改變的關(guān)系。本文以2個不同煙草赤星病抗性品種為材料，探討煙草赤星病脅迫對光合作用、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響，分析煙草赤星病脅迫與光合性能及相關(guān)指標(biāo)之間的關(guān)系，旨在揭示不同煙草品種對煙草赤星病抗性差異及其生理原因，以期為抗煙草赤星病新品種選育提供理論依據(jù)和參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以抗煙草赤星病品種凈葉黃（JYH）、感病品種長脖黃（CBH）為試驗材料。以致病力較強的菌株GM831為供試菌株。

1.2 試驗設(shè)計及取樣

挑選生長整齊一致的壯苗（6葉1心）進(jìn)行盆栽種植，行株距為110×60 cm，每盆植煙一株，每個品種共計種植50盆。每盆裝土10 kg，供試土壤為壤質(zhì)潮土（有機質(zhì) 8.50 g·kg-1、全氮 0.89 g·kg-1、速效氮 65.46 mg·kg-1、速效磷 24.42 mg·kg-1、速效鉀108.00 mg·kg-1，pH 7.91）。 每 盆 N、P2O5、K2O 的施入量分別為0.13、0.13、0.39 g·kg-1。移栽45天時現(xiàn)蕾打頂，每株留葉數(shù)均為18片葉，其他管理措施按照優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程進(jìn)行。

當(dāng)下部煙葉變黃成熟時（移栽后50d），開始進(jìn)行煙草赤星病菌接種。將孢子懸浮液以懸滴法接種于煙株的第3、4葉位葉片（自下而上數(shù)，下同），均等距離每葉點12滴，每滴為25 μL，以1%無菌葡萄糖溶液處理為對照[13]。根據(jù)在品種、溫度和菌株組成一定的條件下，葉面濕潤時數(shù)與煙草赤星病侵染概率呈線性關(guān)系這一研究結(jié)論[14]，將接種煙株在人工氣候室中25 ℃分別保濕24、96和168 h，9 d后統(tǒng)計發(fā)病情況。根據(jù)張明厚的分級標(biāo)準(zhǔn)[15]，調(diào)查發(fā)病情況，計算發(fā)病率和病情指數(shù)。根據(jù)病情指數(shù)，把葉片分為正常生長(CK，病情指數(shù)0，無病癥)、輕度脅迫(病情指數(shù)25%)、中度脅迫(病情指數(shù)50%)和重度脅迫(病情指數(shù)75%)。選取第10葉位葉片進(jìn)行各項指標(biāo)測定。

1.3 試驗測定指標(biāo)及方法

1.3.1 光合色素含量

參照Porra的方法[16]，稱取新鮮煙草葉片0.1 g，剪碎后放入10 mL容量瓶中，用80%丙酮定容至10 mL，搖勻后置暗處浸提48 h，期間震蕩3次,至葉片完全發(fā)白,色素全部溶于丙酮溶液中?；靹蚝蠓謩e在663、646和470 nm處比色，根據(jù)公式計算光合色素含量。

1.3.2 光合作用氣體交換參數(shù)

在晴天上午9:30-11:30，采用LI-6400便攜式光合儀（Li-Cor Inc.，USA）測定凈光合速率（Pn，μmol·m-2·s-1），氣孔導(dǎo)度 (Gs，mmol·m-2·s-1)，胞間CO2濃度（Ci，μmol·mol-1），氣孔限制值（Ls）根據(jù)Berry的方法計算（Ls＝1-Ci/C0）（C0為空氣中CO2濃度）[17]。測定時選擇紅藍(lán)光源葉室，使用開放式氣路，葉室溫度設(shè)定為25 ℃，空氣相對濕度為60-70%，CO2濃度為 400 μmol·mol-1，光照強度為 l000 μmol·m-2·s-1，光量子通量密度 800 mol·m-2·s-1。每株測1片葉,每個葉片測定3次,每處理重復(fù)5次，取平均值。

1.3.3 脯氨酸、可溶性總糖和丙二醛含量

脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測定[18],可溶性總糖含量采用蒽酮法測定[19],MDA含量測定采用TBA法[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法檢驗顯著性，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草赤星病脅迫對不同抗性煙草品種光合色素含量的影響

如表1所示，煙草赤星病導(dǎo)致CBH的光合色素含量下降，不同脅迫程度處理與對照相比，均達(dá)到顯著差異水平。在重度脅迫下，CBH的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素較對照分別下降43.92%、22.81%、38.07%和71.92%。而JYH的光合色素含量在輕度脅迫下增加，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量較對照分別上升1.51%、1.26%、2.35%和1.59%，但無顯著差異；此后，隨著脅迫程度的加劇，光合色素含量下降，在重度脅迫下，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的降幅分別為15.07%、19.93%、16.91%和21.59%，與對照相比均達(dá)到顯著差異水平。

表1 煙草赤星病脅迫對不同抗性煙草品種光合色素含量的影響Tab.1 Effects of tobacco brown spot stress on photosynthetic pigment content of two tobacco cultivars with different resist ance mg·g-1

2.2 煙草赤星病脅迫對不同抗性煙草品種光合作用參數(shù)的影響

光合作用為植物提供所需的物質(zhì)和能量，是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，光合作用參數(shù)的變化可以直接反映煙草赤星病脅迫對煙株光合作用的抑制程度。

從表2可以看出， CBH受到煙草赤星病脅迫后，凈光合速率（Pn）呈下降趨勢，且隨著脅迫程度的加劇，降幅也隨之增加，重度脅迫下，CBH的Pn較對照下降31.41%，達(dá)到顯著差異水平。在輕度脅迫下，JYH的Pn較對照有小幅上升，增幅為1.81%，但差異不顯著，此后下降；重度脅迫下，降幅達(dá)到10.25%，與對照相比達(dá)到顯著差異水平。

煙草赤星病脅迫使不同抗性品種的氣孔導(dǎo)度（Gs）降低，CBH的降幅明顯高于JYH（表2）。除輕度、中度脅迫使JYH的Gs降幅未達(dá)到顯著差異外，JYH、CBH的Gs在煙草赤星病脅迫處理下與對照均達(dá)到顯著差異水平，重度脅迫下降幅分別為19.23%、48.94%。煙草赤星病脅迫引起Gs下降，導(dǎo)致光合作用所需的CO2向葉肉細(xì)胞的運輸受阻，且CBH受阻程度更大。

正常生長條件下，不同抗性品種的胞間CO2濃度（Ci）相差不大。如表2所示，在輕度、中度脅迫下，JYH的Ci較對照降低2.64%、4.53%，但未達(dá)到顯著差異水平。而CBH則呈上升趨勢，增幅為5.17%、9.58%，差異達(dá)到顯著水平。此后，隨著脅迫程度的增加，2個品種的Ci均升高。在重度脅迫下，JYH、CBH的Ci增幅分別為7.17%、15.13%，均達(dá)到顯著差異水平。Ci升高,表明葉肉細(xì)胞光合能力下降,導(dǎo)致CO2過剩,同時光合產(chǎn)物相應(yīng)減少。

從表2可以看出，在輕度、中度脅迫下，JYH的氣孔限制值（Ls）呈上升趨勢，較對照分別升高10.71%、17.86%，但差異不顯著；在重度脅迫下，Ls則呈下降趨勢,與對照相比，下降幅度為39.39%，呈顯著差異水平。而CBH在煙草赤星病脅迫下，Ls均呈下降趨勢，與對照相比，在輕度、中度和重度脅迫下分別降低22.86%、45.71%和65.71%，差異均達(dá)到顯著水平。

表2 煙草赤星病脅迫對不同抗性煙草品種光合作用參數(shù)的影響Tab.2 Effects of tobacco brown spot stress on photosynthetic parameters of two tobacco cultivars with different resistance

2.3 煙草赤星病脅迫對不同抗性煙草品種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

隨著煙草赤星病脅迫的加劇，2個品種的脯氨酸和可溶性總糖含量均呈上升趨勢（圖1A、B），在重度脅迫下，JYH、CBH的脯氨酸和可溶性總糖含量分別較對照升高216.61%、196.58%和74.69%、46.92%，差異均達(dá)到顯著水平。JYH的上升速度高于CBH，表明JYH的滲透調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)能力高于CBH，清除葉片內(nèi)活性氧的能力較強。

煙草赤星病脅迫導(dǎo)致2個品種的MDA含量均升高（圖1C）,但增幅不同。在輕度、中度脅迫下,JYH的MDA含量與對照差異不顯著，在重度脅迫下，較對照增加84.55%，達(dá)到顯著差異水平。而CBH的MDA含量在輕度、中度和重度脅迫下,分別比對照升高30.34%、85.33%和134.15%，各處理間差異顯著。在重度脅迫處理下CBH的MDA積累量是JYH的1.36倍，CBH膜系統(tǒng)受損程度嚴(yán)重。

圖1 煙草赤星病脅迫對不同抗性煙草品種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Fig.1 Effects of tobacco brown spot stress on the osmotic adju stment content of two tobacco cultivars with different resistan ce

3 討論

3.1 煙草赤星病脅迫對光合色素的影響

植物進(jìn)行光合作用的能量主要來源于光合色素捕獲的光能，所以光合色素含量的高低與光合功能密切相關(guān)[21]。在本文中，不同抗性品種的葉綠素和類胡蘿卜素含量在煙草赤星病脅迫下均有所下降，說明煙草赤星病不僅使光合色素合成受阻,也促進(jìn)光合色素的降解。其主要原因可能是葉片感染煙草赤星病后，導(dǎo)致葉綠素分解酶活性上升，使葉綠素轉(zhuǎn)化為葉綠素酯和葉綠素醇，因此光合色素含量降低[22]；也有可能是煙草赤星病破壞葉綠體結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致光合色素含量下降[6]。光合色素含量降低，在一定程度上減少葉片的有效光合面積，限制碳素同化能力，從而抑制光合作用。煙草赤星病脅迫下JYH的葉綠素和類胡蘿卜素含量高于CBH，表明抗病品種的光能轉(zhuǎn)換、吸收和傳遞能力較強，在煙草赤星病脅迫下仍具有較高的光合速率，維持光合作用的正常進(jìn)行。而感病品種光合色素含量大幅下降，光合作用減弱，使光合產(chǎn)物積累減少，碳素同化能力受到嚴(yán)重抑制，加速衰老死亡。

3.2 煙草赤星病脅迫對光合作用的影響

光合作用是植物生長的生理基礎(chǔ)，反映植株的生長勢和抗逆性。導(dǎo)致光合速率降低的因素包括氣孔限制和非氣孔限制。根據(jù)Farquhar和Sharkey[23]的氣孔限制值分析觀點，判定引起光合速率降低主要因素的依據(jù)是Ci和Ls的變化方向，Ci降低和Ls升高表明氣孔導(dǎo)度降低是主要原因，而Ci增高和Ls降低則表明引起光合速率降低的主要原因是非氣孔因素。

在本文中，JYH在輕度、中度脅迫下，Ls升高，同時伴隨Ci降低，表明氣孔導(dǎo)度導(dǎo)致CO2供應(yīng)減少是引起Pn下降的主要原因，這是因為煙草赤星病脅迫使葉片氣孔收縮，氣孔導(dǎo)度降低，引起CO2由外界向細(xì)胞內(nèi)擴散的阻力增加，光合碳固定的底物減少[24]。而在重度脅迫下，Ci轉(zhuǎn)向升高，Ls下降，這可能是由于隨著脅迫程度的增加，赤星病破壞光合機構(gòu)，造成葉肉細(xì)胞氣孔擴散阻力增加，Rubisco酶對CO2的親和力降低，碳同化能力下降，說明此時非氣孔限制已成為導(dǎo)致光合速率降低的主要因素。而CBH在煙草赤星病侵染下，Ci上升，而Ls降低，表明感病品種光合作用下降主要是由非氣孔限制因素引起。這是由于煙草赤星病脅迫破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，光合器官受到不可逆?zhèn)?，光合?xì)胞活性降低[25]。CBH的光合參數(shù)受煙草赤星病脅迫影響明顯大于JYH，表現(xiàn)感病特性，而JYH在煙草赤星病脅迫下具有相對較高的光合速率和氣孔開放度，表現(xiàn)出良好的抗病性。

3.3 煙草赤星病脅迫對滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

滲透調(diào)節(jié)是植物對逆境脅迫產(chǎn)生保護(hù)性反應(yīng)的一個重要生理機制，在一定脅迫范圍內(nèi)，脯氨酸、可溶性總糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成,能夠保持類囊體膜與細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)完整性與功能穩(wěn)定性,使光合作用正常進(jìn)行[26]。

Dhinsa指出，抗性強的品種在逆境條件下能夠降低膜脂過氧化水平，從而減輕膜傷害程度[20]。文中研究結(jié)果表明，JYH的MDA含量低于CBH，而脯氨酸和可溶性總糖含量較高，表明抗病品種具有較強的滲透調(diào)節(jié)能力，能夠清除較多的活性氧以減輕細(xì)胞膜傷害程度，從而維持較高的光合速率。這可能與脯氨酸和可溶性糖具有滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和調(diào)節(jié)信號雙重功能有關(guān)[27]。而煙草赤星病脅迫下煙草葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(脯氨酸和可溶性總糖)如何協(xié)調(diào)光合代謝相關(guān)機制需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，凈葉黃品種具有較強的光合作用和滲透物質(zhì)調(diào)節(jié)能力，是對煙草赤星病脅迫具有較強抗性的生理基礎(chǔ)。

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Effects of tobacco brown spot stress on photosynthesis and osmotic regulation in tobacco cultivars with different resistance

YANG Zhixiao1,2,XUE Gang1,DING Yangfang3,ZHANG Xiaoquan1,LIU Hongfeng4,ZHANG Jie5,WANG Yi2,REN Xueling2,YANG Tiezhao1
1 College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;
2 Key Laboratory of Molecular Genetics,Guizhou Academy of Tobacco Science,Guiyang 550081,China;
3 Tobacco Research Institute of Henan Academy of Agricultural Sciences,Xuchang,Henan 461000,China;
4 Guizhou Guiyang County Tobacco Company,Guiyang 550000,China;
5 Guizhou Tianzhu County Tobacco Company,Qiandongnan 556600,Guizhou,China

Responses of photosynthetic characteristics and osmotic regulation were studied under three different stress levels of tobacco brown spot at pot experiment condition,and two tobacco cultivars with different resistance to tobacco brown spot including a resistant cultivar Jingyehuang (JYH) and sensitive one Changbohuang (CBH) were selected as experimental material.Results showed that tobacco brown spot stress decreased chlorophyll a,chlorophyll b,total chlorophyll and carotenoids in the two cultivars.In addition,the decreased range of photosynthetic pigments was less in JYH than that in CBH.Both the net photosynthetic rate and the stomatal conductance were inhibited under tobacco brown spot stress.However,the net photosynthetic rate of JYH increased under mild stress whereas there was a decrease under moderate and severe stress.In the two cultivars,changes in intercellular CO2concentration and stomatal conductance were divergent.The intercellular CO2concentration in CBH tended to rise under the three stress levels,whereas the stomatal limitation value showed a significant decrease.In JYH under severe stress,the photosynthetic parameters consisting of both intercellular CO2concentration and stomatal conductance showed the same trend as in CBH.However,in contrast with the rising trend of intercellular CO2concentration under severe stress,the stomatal limitation value of JYH decreased under both mild and moderate stress.Compared with CBH,JYH showed higher content of total soluble sugar and proline and lower content of MDA under three stress levels.These results indicate that,JYH featured higher photosynthetic performance and betterosmotic adjustment,which formed the physiological basis for strong resistance to tobacco brown spot stress.

tobacco;tobacco brown spot;photosynthetic pigment;photosynthesis;osmotic regulation

楊志曉,薛剛，丁燕芳,等.煙草赤星病脅迫對不同抗性品種光合特性和滲透調(diào)節(jié)的影響[J].中國煙草學(xué)報，2015,21（3）

中國煙草總公司科技項目（110201002008，Ts-01-2011003）;貴州省煙草專賣局資助項目（中煙黔科〔2012〕11號）;河南省煙草專賣局科技攻關(guān)項目（hykj200817）

楊志曉(1981—),博士研究生，研究方向為煙草抗病育種，Email：linyingxian2006@126.com

楊鐵釗（1956—）,教授,博導(dǎo),主要從事煙草遺傳育種研究,Email：yangtiezhao@126.com

2014-06-04

: YANG Zhixiao,XUE Gang,DING Yangfang,et al.Effects of tobacco brown spot stress on photosynthesis and osmotic regulation in tobacco cultivars with different resistance [J]Acta Tabacaria Sinica,2015,21(3)