黃芩不同藥用部位水煎液對急性肝損傷小鼠保肝作用的研究

耿廣琴， 楊志軍， 楊秀娟， 李 晶

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730000）

黃芩不同藥用部位水煎液對急性肝損傷小鼠保肝作用的研究

耿廣琴， 楊志軍*， 楊秀娟， 李 晶

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730000）

目的 研究黃芩水煎液對CCl4致肝損傷模型小鼠肝細(xì)胞DNA及肝超微結(jié)構(gòu)的影響，探討黃芩莖葉保肝作用的效果。方法 將72只小鼠，隨機分為正常對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯對照組、7月份黃芩莖葉組、10月份黃芩莖葉組、黃芩根組。正常對照組、模型組每日每只給予0.2 mL/10 g的生理鹽水，聯(lián)苯雙酯對照組每日每只給予聯(lián)苯雙酯150 mg/kg，黃芩各組每日每只按相當(dāng)于生藥量6 g/kg劑量給小鼠灌服黃芩水煎液，連續(xù)灌胃7 d。末次給藥2 h后，除正常對照組外，其余各組均腹腔注射0.1%CCl4橄欖油溶液0.1 mL/10 g建立小鼠急性肝損傷模型，正常對照組腹腔注射等體積橄欖油。18 h后，剖取肝組織，檢測肝細(xì)胞DNA損傷，觀察肝超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果 給予黃芩水煎液后，小鼠肝細(xì)胞DNA尾長、尾矩、Olive尾矩均有所減少，其中黃芩根組與模型組相比，差異極顯著 （P＜0.01），莖葉組與模型組相比，差異不顯著 （P＞0.05）。黃芩根組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，黃芩莖葉組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器腫脹，部分線粒體空泡變性，對肝超微結(jié)構(gòu)的損傷緩解作用不顯著。結(jié)論 黃芩根水煎液具有一定的保肝作用，與黃芩根相比，黃芩莖葉的作用較弱，黃芩莖葉的藥用功效尚需進(jìn)一步開展實驗研究。

黃芩；不同部位；肝損傷模型；DNA損傷；超微結(jié)構(gòu)變化

黃芩Scutellaria baicalensis Georgi是我國常用中藥材，使用歷史悠久。傳統(tǒng)藥用其根，莖葉部分通常被廢棄。隨著對黃芩化學(xué)成分、藥理作用研究的深入，發(fā)現(xiàn)不僅黃芩的根有著廣泛的藥用功效，其莖葉也是不容忽視的良好藥材［1-2］。有研究表明黃芩莖葉與黃芩根相同，也具有較好的抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保肝等藥理活性［3-6］。為科學(xué)評價黃芩莖葉的藥用價值，本實驗通過研究黃芩水煎液對CCl4致肝損傷模型小鼠肝細(xì)胞DNA及肝超微結(jié)構(gòu)的影響，探討黃芩莖葉保肝作用的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 黃芩莖葉，分別于7月底、10月底采自甘肅隴西；黃芩根，兩年生，11月初采自甘肅隴西，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院杜弢教授鑒定為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi。取黃芩根、莖葉適量，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加8倍量水煎煮1 h，合并2次提取液，過濾后，水浴濃縮成含生藥量為1 g/mL的水煎劑，分光光度法測得根中黃芩總黃酮的量為10.21%，7月份莖葉中黃芩總黃酮的量為3.01%，10月份莖葉黃芩總黃酮的量為1.58%。高壓滅菌，置4℃冰箱備用。

1.2 動物 2月齡昆明種小鼠72只 （SPF級），雌雄各半，體質(zhì)量 （20±2）g，購自蘭州大學(xué)實驗動物中心。合格證號：SCXK（甘）2009-0004。

1.3 試劑 四氯化碳 （CCl4，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號120728），使用時用橄欖油配制成0.1%的橄欖油溶液；聯(lián)苯雙酯滴丸 （北京協(xié)和藥廠，批號12090204），使用時用蒸餾水溶解稀釋至所需劑量。正常熔點的瓊脂糖 （NMA），低熔點的瓊脂糖 （LMA），均為美國Sigma公司產(chǎn)品；臺盼蘭，三羥甲基氨基甲烷 （Tris），二甲基亞砜 （DMSO）、溴化乙錠 （EB）等均為國產(chǎn)分析純。

1.4 儀器 BS224S型電子天平 （賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 （鄭州杜甫儀器廠產(chǎn)品）；XYJ80-20型離心機 （金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品）；XW-80A型旋渦混勻器 （上海精科實業(yè)有限公司產(chǎn)品）；DYY-Ⅲ型電泳儀（北京六一廠產(chǎn)品）；CKX41-F32FL熒光倒置顯微鏡 （日本奧林巴斯公司出品）；JEOL-1230透射電子顯微鏡 （日本電子公司生產(chǎn)產(chǎn)品）。

2 方法

2.1 小鼠分組與造模 將72只小鼠，隨機分為6組，每組12只，雌雄各半，分別為正常對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯對照組、7月份黃芩莖葉組、10月份黃芩莖葉組、黃芩根組（根據(jù)前期小鼠組織中SOD活性、MDA水平等指標(biāo)的檢測結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)黃芩水煎劑高劑量6 g生藥/kg保肝作用較理想，本實驗中不再設(shè)置黃芩低、中劑量治療組）［7］。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，采用灌胃給藥。正常對照組、模

型組每日每只給予0.2 mL/10 g的生理鹽水，聯(lián)苯雙酯對照組每日每只給予聯(lián)苯雙酯150 mg/kg，黃芩各組每日每只按相當(dāng)于生藥量6 g/kg給小鼠灌服黃芩水煎液，連續(xù)灌胃7 d。末次給藥2 h后，除正常對照組外，其余各組均腹腔注射0.1%CCl4橄欖油溶液0.1 mL/10 g建立小鼠急性肝損傷模型，正常對照組腹腔注射等體積橄欖油。

禁食不禁水18 h后，各組小鼠稱重，斷頭處死，迅速剖取肝組織，用預(yù)冷的4℃生理鹽水洗凈表面殘血備用。

2.2 單細(xì)胞凝膠電泳（SCGE）檢測DNA損傷 用37℃的PBS緩沖液沖洗肝組織，勻漿，加適量PBS懸浮細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液于1.5 mL的ephendorf管中，靜置下沉3 min，將上部懸液轉(zhuǎn)至另一ephendorf管中，800 r/min離心5 min，棄上清，用PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整至104～105個/mL。臺盼蘭檢測細(xì)胞活率，大于90%方可進(jìn)行實驗。

單細(xì)胞凝膠電泳按照Singh［8］描述的方法稍加改進(jìn)，25 V，300 mA，電泳30 m in。EB染色，熒光顯微鏡下觀察，拍照。選擇尾長（tail length，TL）、尾矩（tail moment， TM）、Olive尾矩（Olive tail moment，OTM）為DNA損傷指標(biāo)。

2.3 超微結(jié)構(gòu)觀察 取大鼠肝組織結(jié)構(gòu)1 mm3，3%戊二醛固定液固定，環(huán)氧樹脂包埋，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡下定位，超薄切片后，透射電子顯微鏡觀察肝組織結(jié)構(gòu)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計與分析，實驗結(jié)果以表示，組間差異采用one-way ANOVA分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

3 結(jié)果

3.1 小鼠肝細(xì)胞DNA損傷 如表1所示，模型組小鼠肝細(xì)胞DNA尾長、尾矩、Olive尾矩較正常對照組均明顯增加 （P＜0.01）。給予黃芩水煎液后，小鼠肝細(xì)胞DNA尾長、尾矩、Olive尾矩均有所減少，其中黃芩根組與模型組相比，差異極顯著 （P＜0.01），莖葉組與模型組相比，差異不顯著 （P＞0.05）。

表1 小鼠肝細(xì)胞DNA損傷（，n=12）

表1 小鼠肝細(xì)胞DNA損傷（，n=12）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 動物數(shù)/只 尾長（TL）/μm 尾矩（TM）/μm Olive尾矩（OTM）/μm正常對照組 12 3.89±0.24** 0.73±0.05** 0.57±0.04**模型組 12 19.11±0.53## 6.93±0.35## 6.11±0.27##聯(lián)苯雙酯對照組 12 5.52±0.38**## 1.00±0.06** 0.62±0.04**7月份黃芩莖葉組 12 17.94±0.35*## 6.71±0.20## 5.43±0.28*##10月份黃芩莖葉組 12 18.77±0.43## 6.78±0.28## 5.97±0.20##黃芩根組 12 6.56±0.26**## 1.20±0.13** 0.71±0.03**

3.2 肝超微結(jié)構(gòu)變化 肝臟超微結(jié)構(gòu)變化見圖1。正常對照組肝細(xì)胞核呈橢圓形，核膜平整光滑，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、核糖體等結(jié)構(gòu)正常，肝血竇面及肝血竇腔正常；模型組肝細(xì)胞核體積相對于正常略有縮小，核異染色質(zhì)增多，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯減少，部分線粒體腫脹。聯(lián)苯雙酯對照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞之間連接結(jié)構(gòu)正常；7月份黃芩莖葉組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器腫脹，部分線粒體空泡變性，肝血竇面異常明顯，肝血竇腔高度腫脹；10月份黃芩莖葉組肝細(xì)胞核形態(tài)異常，核體積縮小，核周異染色質(zhì)增多，肝血竇腔電子密度降低，部分線粒體空泡變性；黃芩根組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，但個別線粒體有腫脹現(xiàn)象。

4 討論

在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷中，過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的氧自由基是肝損傷形成的主要機制［9-11］。體內(nèi)累積過多的氧自由基將攻擊膜不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子，損傷這些生物大分子，影響他們的功能［12-14］。

DNA是重要的遺傳物質(zhì)，DNA通過轉(zhuǎn)錄和翻譯將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)作為生命活動的執(zhí)行者，因此，DNA的穩(wěn)定對于生命體的正常繁殖和生長是至關(guān)緊要的。DNA鏈的斷裂可使核酸的完整性和核型受到破壞，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失調(diào)，影響蛋白質(zhì)的合成，最終引起細(xì)胞死亡。

圖1 各組小鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) （×10 000）

SCGE結(jié)果顯示模型組小鼠肝細(xì)胞DNA尾長、尾矩、Olive尾矩明顯增高，說明CCl4誘導(dǎo)了肝細(xì)胞DNA損傷，給予黃芩根水煎劑后，模型小鼠肝細(xì)胞DNA損傷減輕，表明黃芩根水煎液對維持肝細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有積極的作用。黃芩莖葉水煎液與模型組相比，雖可以降低肝損傷小鼠肝細(xì)胞DNA尾長、尾矩、Olive尾矩，減輕肝細(xì)胞DNA的損傷強度，但差異并不顯著。

肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，模型組肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯異常改變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞核體積相對縮小，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯減少。黃芩

根組明顯改善肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，黃芩莖葉組呈現(xiàn)出細(xì)胞核形態(tài)異常，細(xì)胞器明顯腫脹，部分線粒體空泡變性等癥狀，表明黃芩莖葉水煎液對肝超微結(jié)構(gòu)的損傷緩解作用不顯著，與肝細(xì)胞DNA損傷的測定結(jié)果相一致。

孟艷彬［15］等采用紫外分光光度法對連續(xù)3年的黃芩莖葉總黃酮的量進(jìn)行測定，采用HPLC法對一年內(nèi)不同月份黃芩莖葉的總黃酮的量進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩莖葉總黃酮以7、8月份的量較高。本實驗參照文獻(xiàn)，同時從中藥生產(chǎn)實際出發(fā)，分別采集7月份、10月份黃芩莖葉，研究其對肝細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果表明，7月份黃芩莖葉水煎液對肝細(xì)胞的保護(hù)作用稍高于10月份黃芩莖葉水煎液，但二者對肝細(xì)胞的保護(hù)效果均明顯弱于黃芩根水煎液。這與分光度法測定根、莖葉中黃芩有效成分總黃酮的量高低相符合，表明黃芩保肝的療效與其所含的活性物質(zhì)總黃酮的量密不可分，黃酮含有量的高低直接影響著黃芩藥理作用的發(fā)揮。

綜上所述，黃芩根水煎液具有一定的保肝作用，其作用機理可能是通過減輕肝細(xì)胞DNA的損傷，減緩肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)異常變化，而起到保護(hù)肝臟的作用，與黃芩根相比，黃芩莖葉的作用較弱，黃芩莖葉的藥用功效尚需進(jìn)一步開展實驗研究。

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R285.5

B

1001-1528（2015）12-2753-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.039

2014-07-10

2012甘肅省高校基本科研業(yè)務(wù)費項目 《甘肅黃芩品質(zhì)的綜合考察與評價研究》（BH2012-020）

耿廣琴 （1971—），女，動物學(xué)碩士，講師，主要從事生物化學(xué)的教學(xué)及研究。Tel：13893468930，E-mail：gengguangqin94 @126.com

*通信作者：楊志軍，女，副教授。主要從事中藥學(xué)的教學(xué)及研究。Tel：13389310964，E-mail：yangzhijun@yeah.net