電導(dǎo)率測(cè)定法在中藥有效成分提取過程中的應(yīng)用研究

孫冬梅， 陳 卉，2*， 王洛臨， 陳 朋，2， 周 蓉，2， 謝 媛，2

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405）

電導(dǎo)率測(cè)定法在中藥有效成分提取過程中的應(yīng)用研究

孫冬梅1， 陳 卉1，2*， 王洛臨1， 陳 朋1，2， 周 蓉1，2， 謝 媛1，2

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405）

目的 研究電導(dǎo)率測(cè)定法在苦參、全蝎、土鱉蟲等中藥有效成分提取過程中的應(yīng)用。方法 采用電導(dǎo)率法測(cè)定苦參、全蝎、土鱉蟲等中藥有效成分提取過程中的電導(dǎo)率變化情況，考察提取液電導(dǎo)率值與有效成分含有量隨提取時(shí)間的變化規(guī)律，以及兩者之間的定量關(guān)系。結(jié)果 苦參提取液電導(dǎo)率值與生物堿總含有量，全蝎、土鱉蟲提取液電導(dǎo)率值與蛋白多肽含有量均呈線性相關(guān)，而且兩者隨提取時(shí)間變化的規(guī)律相似。結(jié)論 該方法可以快速、準(zhǔn)確地指示有效成分的提取規(guī)律和提取終點(diǎn)，在中藥提取工藝中具有一定應(yīng)用價(jià)值。

電導(dǎo)率；中藥；生物堿；蛋白多肽；提取

苦參堿和氧化苦參堿屬于生物堿類化合物，是中藥苦參的藥理活性成分［1-2］，其定量測(cè)定主要采用高效液相色譜法［3-5］，但樣品處理過程復(fù)雜、操作程序繁瑣、對(duì)儀器設(shè)備要求高，而蟲類藥全蝎、土鱉蟲的主要有效成分為蛋白多肽類［6-11］，其含有量測(cè)定方法大多都存在樣品處理時(shí)間長(zhǎng)、有毒試劑使用量大等缺點(diǎn)［12-13］。因此，尋找一種簡(jiǎn)便、快速并能準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)中藥材提取過程的新方法至關(guān)重要。

與傳統(tǒng)分析方法相比，電導(dǎo)率測(cè)定法具有分析快速、操作簡(jiǎn)便、不消耗樣品與試劑等特點(diǎn)，其分析結(jié)果能真實(shí)、準(zhǔn)確地反映提取液中有效成分的提取規(guī)律及提取終點(diǎn)［14-15］。所以，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用電導(dǎo)率法對(duì)苦參藥材提取過程中苦參堿和氧化苦參堿的含有量變化情況進(jìn)行測(cè)定，考察了電導(dǎo)率值與有效成分含有量之間的定量關(guān)系，并進(jìn)一步探討了該方法在蟲類藥全蝎、土鱉蟲有效成分提取過程中的應(yīng)用。

1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；UV-2550紫外可見分光光度計(jì) （日本島津公司）；DDS-307A電導(dǎo)率儀 （上海精密科學(xué)儀器有限公司）；XS205分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；JJ300電子天平 （常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；DZF-6050真空干燥箱 （上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；LXJ-IIB離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；RE 5298 A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠）；KW-1000DC數(shù)顯恒溫水浴鍋 （金壇市科析儀器有限公司）。

苦參、土鱉蟲、全蝎 （鹽制，含鹽量約為15%～17%，廣東省藥材公司中藥飲片廠），經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院王洛臨主任中藥師鑒定，均符合 《中國(guó)藥典》2010年版一部相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定?？鄥A （批號(hào)110805-200508）、氧化苦參堿 （批號(hào)110780-201007，含92.3%C15H24N2O2）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。Lowry法蛋白含量檢測(cè)試劑盒 （南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)KGP420）。乙腈、無水乙醇均為色譜純 （德國(guó)Merck公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 成分定量測(cè)定方法

2.1.1 苦參堿、氧化苦參堿的測(cè)定

2.1.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Waters Spherisorb?NH2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-無水乙醇-3%磷酸溶液（80∶10∶10）；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；體積流量為1.0 mL/min。理論板數(shù)按氧化苦參堿峰計(jì)算，應(yīng)不低于2 000。

2.1.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取苦參堿、氧化苦參堿對(duì)照品適量，置于25 mL量瓶中，加乙腈-無水乙醇 （80∶20）混合溶液至刻度，搖勻，制成每lmL分別含苦參堿389.2μg、氧化苦參堿387.3μg的對(duì)照品貯備液。再分別精密吸取兩種貯備液1、5 mL，混合后置于10 mL量瓶中，加乙腈-無水乙醇 （80∶20）混合溶液至刻度，搖勻，即得每l m L含苦參堿38.92μg、氧化苦參堿193.65μg的混合對(duì)照品溶液。

2.1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取混合對(duì)照品溶液1、2、4、8、12、16、20μL，在 “2.1.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積。以苦參堿的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) （X1），峰面積為縱坐標(biāo) （Y1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得回歸方程Y1=0.491 1X1-0.076 7，r=0.999 9，表明在38.92～778.4 ng范圍內(nèi)苦參堿的峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系；以氧化苦參堿的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) （X2），峰面積為縱坐標(biāo)（Y2）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得回歸方程Y2=0.550 0 X2-0.013 5，r=0.999 9，表明在 193.65～3 873.0 ng范圍內(nèi)，氧化苦參堿的峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.1.1.4 供試品溶液的制備 精密吸取各時(shí)間點(diǎn)提取液5 mL，置于具塞錐形瓶中，60℃下真空干燥，精密加入濃氨試液0.5 mL和三氯甲烷20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理 （功率250 W、頻率33 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，三氯甲烷補(bǔ)

足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 m L，加到中性氧化鋁柱 （100～200目，5 g，內(nèi)徑1 cm）上，依次以三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇（7∶3）混合溶液各20 mL洗脫，合并洗脫液，濃縮回收溶劑至干，殘?jiān)訜o水乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.1.5 測(cè)定方法 分別精密吸取供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定并計(jì)算提取液中生物堿的總含有量?？瞻兹軇?、混合對(duì)照品及供試品的色譜圖見圖1。

圖1 苦參HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram s of Sophorae flavescentis Radix

2.1.2 蛋白多肽類成分的測(cè)定 凱基Lowry法蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定全蝎、土鱉蟲提取液中蛋白多肽類成分。

2.2 提取方法

2.2.1 苦參藥材提取 稱取一定粒度的苦參藥材適量，置于圓底燒瓶中，加入一定體積的提取溶劑，加熱回流提取4 h。按規(guī)定時(shí)間點(diǎn)定時(shí)吸取樣液，4 000 r/min離心10 min以除去樣液中干擾電導(dǎo)率和成分定量測(cè)定的雜質(zhì)微粒，30℃恒溫下測(cè)定樣品溶液的電導(dǎo)率值，并用HPLC法測(cè)定樣品溶液中有效成分的含有量。然后，繪制提取介質(zhì)電導(dǎo)率值、有效成分含有量隨提取時(shí)間變化的提取曲線。

2.2.2 全蝎、土鱉蟲提取 稱取一定粒度的全蝎（脫鹽）、土鱉蟲適量，置于圓底燒瓶中，加入一定體積的提取溶劑，60℃下水浴加熱提取4 h。按規(guī)定時(shí)間點(diǎn)定時(shí)吸取樣液，4 000 r/min離心10 min以除去樣液中干擾電導(dǎo)率和成分定量測(cè)定的雜質(zhì)微粒，30℃恒溫下測(cè)定樣品溶液的電導(dǎo)率值，并用凱基Lowry法蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定樣品溶液中有效成分的含有量。然后，繪制提取介質(zhì)電導(dǎo)率值、有效成分含有量隨提取時(shí)間變化的提取曲線。

2.3 電導(dǎo)率測(cè)定法對(duì)苦參有效成分提取規(guī)律的表征 根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)苦參提取液的電導(dǎo)率與有效成分含有量的測(cè)定結(jié)果，繪制提取時(shí)間分別為60、120、180、240 min時(shí)的電導(dǎo)率值、生物堿總含有量與提取時(shí)間關(guān)系的曲線，結(jié)果見圖2。由圖可知，隨著提取時(shí)間的增加，提取液電導(dǎo)率值、生物堿總含有量均呈增加趨勢(shì)，而且兩者的變化情況具有相同的規(guī)律，即提取前60 min電導(dǎo)率值與生物堿總含有量均增加迅速，60 min后逐漸趨于平緩，180 min后提取過程達(dá)到恒定。

2.4 電導(dǎo)率值與苦參有效成分之間的定量關(guān)系

根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)苦參提取液的電導(dǎo)率與有效成分含有量的測(cè)定結(jié)果，繪制提取液電導(dǎo)率值與生物堿總含有量關(guān)系的曲線，并對(duì)其進(jìn)行線性擬合，發(fā)現(xiàn)電導(dǎo)率值與生物堿總含有量呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6，見圖3。

2.5 電導(dǎo)率測(cè)定法在蟲類藥物提取過程中的應(yīng)用

根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)全蝎、土鱉蟲提取液的電導(dǎo)率與有效成分含有量的測(cè)定結(jié)果，分別繪制兩者的電導(dǎo)率值、蛋白多肽類成分含有量與提取時(shí)間關(guān)系的曲線，結(jié)果見圖4。由圖可知，蟲類藥物提取液的電導(dǎo)率值、蛋白多肽含有量隨提取時(shí)間的變化規(guī)律也相同。

然后，分別繪制全蝎、土鱉蟲提取液的電導(dǎo)率值與蛋白多肽含有量關(guān)系的曲線，并對(duì)其進(jìn)行線性擬合，考察兩者的定量關(guān)系，發(fā)現(xiàn)全蝎、土鱉蟲提取液電導(dǎo)率值與蛋白多肽含有量均呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別r=0.998 6、0.999 4，見圖5。

3 討論

隨著提取時(shí)間的變化，提取液的電導(dǎo)率值與有效成分的含有量具有相同的變化規(guī)律。因此，采用電導(dǎo)率測(cè)定法可以快速、準(zhǔn)確地指示有效成分的提取過程和提取終點(diǎn)，既確保了有效成分提取完全，又及時(shí)指示提取結(jié)束，提高了效率，解決了中藥有效成分傳統(tǒng)分析方法存在的分析周期長(zhǎng)、提取終點(diǎn)判斷滯后等問題。

圖2 苦參有效成分提取過程中電導(dǎo)率值、生物堿總含有量隨提取時(shí)間的變化規(guī)律Fig.2 Variations of specific conductance values and total alkaloid contents w ith extraction tim e in the extraction of effective constituents from Sophorae flavescentis Radix

通過研究不同中藥品種在不同提取條件下的電導(dǎo)率-提取時(shí)間規(guī)律以及電導(dǎo)率值-有效成分含有量之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，使電導(dǎo)率測(cè)定法可以快速、直觀地反映提取過程中有效成分的含有量及其變化規(guī)律，說明該方法不僅能夠應(yīng)用于植物藥有效成分的提取，而且對(duì)動(dòng)物藥也有相同的規(guī)律。因此，可以利用電導(dǎo)率測(cè)定法優(yōu)化中藥材提取工藝條件。

圖3 苦參提取液中電導(dǎo)率值與生物堿總含有量間的關(guān)系Fig.3 Relationship between specific conductance values and total alkaloid contents in Sophorae flavescentis Radix extract

圖4 蟲類藥物有效成分提取過程中電導(dǎo)率值、蛋白多肽含有量隨提取時(shí)間的變化規(guī)律Fig.4 Variations of specific conductance values and protein polypeptide contents w ith extraction time in the extraction of effective constituents from insect drugs

綜上所述，電導(dǎo)率測(cè)定法不僅適用于生物堿、蛋白多肽類成分的提取工藝，而且在黃酮、皂苷類成分提取過程中也得到了證實(shí)，為中藥材提取分離過程的表征提供一種可靠的方法。

圖5 蟲類藥物提取液電導(dǎo)率值與蛋白多肽含有量間的關(guān)系Fig.5 Relationships between specific conductance values and protein polypeptide contents in insect drug extracts

［1］ 顧關(guān)云，肖年生，蔣 昱.苦參的化學(xué)成分、生物活性和藥理作用［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2009，24（5）：265-271.

［2］ 張 翅，馬 悅，高慧敏，等.苦參化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（4）：205-214.

［3］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：188-189.

［4］ 涂瑤生，李紹林，孫冬梅，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選苦參提取工藝［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（5）：34-37.

［5］ 郭德祥，郭亞楠，李向陽(yáng).苦參堿的提取純化工藝研究［J］.中國(guó)獸藥雜志，2014，48（3）：24-26.

［6］ 王鳳霞，吉愛國(guó).藥用土鱉蟲化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2009，30（1）：61-64.

［7］ 高 鵬.土鱉蟲不同工藝提取物抗凝作用的比較研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（7）：1816-1817.

［8］ 劉 丹，李興暖，秦仲君，等.土鱉蟲多肽的制備及免疫調(diào)節(jié)作用研究［J］.中藥材，2012，35（9）：1382-1385.

［9］ 雷田香，彭延古，徐愛良.中藥全蝎的研究進(jìn)展［J］.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，26（4）：60-61.

［10］ 侯 林，田景振，姬 濤.全蝎勻漿提取工藝研究［J］.中成藥，2011，33（10）：1813-1815.

［11］ 羅 躍，彭延古，易小明.全蝎的化學(xué)成分及其作用的研究進(jìn)展［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（3）：78-80.

［12］ 李 玲，洪戰(zhàn)英，董 昕，等.多肽類藥物的質(zhì)量控制及藥動(dòng)學(xué)研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)服務(wù)與研究，2013，13（6）：405-409.

［13］ 胡曉靜，孔成誠(chéng)，方成武，等.不同提取方法鹽全蝎水溶性蛋白含量對(duì)比研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2011，1（5）：38-39.

［14］ 嚴(yán)贊開.電導(dǎo)法測(cè)定橙皮苷［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（9）：2575-2577.

［15］ 張 鵬，高峻峰，孟 碩，等.電導(dǎo)率測(cè)定法在線監(jiān)測(cè)梔子提取物大孔樹脂柱分離工藝［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006，26（4）：60-61.

App lication of specific conductancem ethod in the extraction of effective constituents from traditional Chinesemedicines

SUN Dong-mei1， CHEN Hui1，2*， WANG Luo-lin1， CHEN Peng1，2， ZHOU Rong1，2， XIE Yuan1，2
（1.Guangdong Provincial Engineering and Technology Research Institute of ChineseMedicine，Guangdong Provincial Key Laboratory of ChineseMedicine Research and Development，Guangzhou 51OO95，China；2.Guangzhou University of ChineseMedicine，Guangzhou 51O4O5，China）

AIM To study the application of specific conductancemethod on the extraction of effective constituents from Sophorae Flavescentis Radix，Scorpio and Eupolyphaga.METHODS The changes ofspecific conductances in the extraction of effective constituents from Sophorae Flavescentis Radix，Scorpio and Eupolyphaga were determined by specific conductance method.The variations of specific conductance values and contents of effective constituents，together with the quantitative relationships between these two evaluation indicators were investigated. RESULTS The specific conductance value of Sophorae Flavescentis Radix extract had a linear relationship with the total content of alkaloid，and the specific conductance values of Scorpio and Eupolyphaga extracts also had line-

specific conductance；traditional Chinesemedicines；alkaloid；proteins polypeptide；extracion

R284.2

A

1001-1528（2015）12-2686-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.025

2015-01-06

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目 （2012A030100017）

孫冬梅 （1969—），女，主任中藥師，主要從事中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。Tel：（020）83501292，E-mail：tcmgdp@163.com

*通信作者：陳 卉（1987—），女，博士生，主要從事中藥制劑研究。Tel：13631433952，E-mail：chenhuicherry1987@163.com

日期：2015-03-18

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20150318.1019.002.htm l

ar relationshipswith the content of protein polypeptide.In addition，the variations of them with the changes of extraction time were similar.CONCLUSION Thismethod can rapidly and accurately indicate the pattern and terminal point in the extraction of effective constituents，having a certain value in the extraction process of traditional Chinesemedicines.