穿山龍中原薯蕷皂苷雜質(zhì)的分離與鑒定

張 杰， 胡天宇， 沈國(guó)亮， 楊 陽(yáng)， 顧正兵*

（1.江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 泰州225300；2.中國(guó)藥科大學(xué)制藥工程系，江蘇南京211198；3.東南大學(xué)成賢學(xué)院，江蘇南京210088）

穿山龍中原薯蕷皂苷雜質(zhì)的分離與鑒定

張 杰1， 胡天宇2， 沈國(guó)亮1， 楊 陽(yáng)3， 顧正兵1*

（1.江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 泰州225300；2.中國(guó)藥科大學(xué)制藥工程系，江蘇南京211198；3.東南大學(xué)成賢學(xué)院，江蘇南京210088）

目的 對(duì)穿山龍Dioscorea nipponica Makino中原薯蕷皂苷所含雜質(zhì)的化學(xué)成分進(jìn)行研究。方法 從穿山龍?zhí)崛∥镏械玫皆硎氃碥沾制?，再采用大孔吸附?shù)脂、制備HPLC法進(jìn)行分離純化，并根據(jù)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定所得化合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果 從中分得3個(gè)雜質(zhì)，經(jīng)鑒定分別為黃山藥皂苷H（dioscoreside H，1）、原纖細(xì)薯蕷皂苷（protogracillin，2）和26-0-β-D-吡喃葡萄糖基-（25R）-呋甾烷-5-烯-3β，22ξ，26-三醇-3-0-［α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）］-β-D-吡喃葡萄糖苷（26-0-β-D-glucopyranosyl-［25R］-furost-5-en-3β，22ξ，26-triol-3-0-［α-L-rhamnopyranosyl｛1→4｝-β-D-glucopyranoside，3）。結(jié)論 化合物1和3為首次從穿山龍中分離得到。

穿山龍；原薯蕷皂苷；黃山藥皂苷H；原纖細(xì)薯蕷皂苷；26-0-β-D-吡喃葡萄糖基-（25R）-呋甾烷-5-烯-3β，22ξ，26-三醇-3-0-［α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）］-β-D-吡喃葡萄糖苷

安全性是藥物在整個(gè)研發(fā)、生產(chǎn)和制作過(guò)程中的核心內(nèi)容，而藥品中的雜質(zhì)則是其質(zhì)量控制、安全性和毒副作用評(píng)價(jià)的重點(diǎn)，它涉及到藥學(xué)研究的方方面面?！吨袊?guó)藥典》2010版規(guī)定，任何影響藥品純度的物質(zhì)均稱為雜質(zhì)［1］。其中，化藥的雜質(zhì)主要來(lái)源于合成過(guò)程中的副產(chǎn)物和未反應(yīng)完全的物料等，各國(guó)藥典均有嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而中藥的雜質(zhì)主要來(lái)源于分離純化的原藥材，由于其成分的多樣性和復(fù)雜性，相關(guān)分析研究及質(zhì)量控制比化藥難度更大，重視程度也相對(duì)欠缺，并且 《中國(guó)藥典》2010版對(duì)其暫未有明確的規(guī)定。

原薯蕷皂苷為穿山龍Dioscorea nipponica Maki-

no的主要活性成分之一，屬于水溶性甾體皂苷，現(xiàn)代研究表明，它具有增強(qiáng)男性性功能、降血脂、抗癌、抗白血病等較強(qiáng)的藥理作用，有著良好的應(yīng)用前景［2-6］。在前期，我們已研發(fā)出一條從穿山龍藥材中分離得到高純度原薯蕷皂苷的優(yōu)化工藝路線，并申請(qǐng)了專利［7］。在此基礎(chǔ)上，為了對(duì)原薯蕷皂苷原料的質(zhì)量加以控制，以及后續(xù)對(duì)其深入的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其中微量雜質(zhì)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究。在上述專利工藝路線指導(dǎo)下，以原薯蕷皂苷原料為對(duì)照，運(yùn)用現(xiàn)代分離技術(shù)，從穿山龍藥材中分離、富集和純化目標(biāo)雜質(zhì)成分，最終得到3個(gè)化合物。經(jīng)波譜解析，分別鑒定為黃山藥皂苷H（dioscoreside H，1）、原纖細(xì)薯蕷皂苷（protograllin，2）和26-0-β-D-吡喃葡萄糖基-（25R）-呋甾烷-5-烯-3β，22ξ，26-三醇-3-0-［α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）］-β-D-吡喃葡萄糖苷（26-0-β-D-glucopyranosyl-（25R）-furost-5-en-3β，22ξ，26-triol-3-0-［α-L-rhamnopyranosyl（1→4）］-β-D-glucopyranoside，3），并通過(guò)色譜和光譜分析確定這3個(gè)化合物即為該原料中的雜質(zhì)成分，見(jiàn)圖1。色譜條件為Kromasir C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（27∶73）；柱溫為35℃；體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為20μL；漂移管溫度為104℃；氣體體積流量為2.8 L/min。

圖1 化合物1～3和原薯蕷皂苷原料的色譜圖Fig.1 Chromatograms of compounds 1-3 and protodioscin raw material

1 儀器與試藥

Varian INOVA-400核磁共振儀，TMS為內(nèi)標(biāo)（美國(guó)瓦里安公司）；Waters Delta Prep 4000制備型、Waters 1525分析型高效液相色譜儀 （美國(guó)Waters公司）；Q-Tof質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent Technologies公司）；ELSD-UM5000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（上海通微分析技術(shù)有限公司）。甲醇、乙腈均為色譜純 （德國(guó)Merck公司）；其他試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

穿山龍藥材購(gòu)自安徽省亳州市藥材市場(chǎng)，經(jīng)嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院王峻副教授鑒定為穿山龍Dioscorea nipponica Makino的根莖。原薯蕷皂苷原料為實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)面積歸一化法測(cè)定，其純度大于98%。

2 提取與分離

取干燥的穿山龍藥材100 kg，粉碎后過(guò)3號(hào)篩，10倍量70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.18，靜置后取上清液，經(jīng)AB-8吸附樹(shù)脂柱層析 （柱體積為250 L），依次用水和20%乙醇分別洗脫3個(gè)和5個(gè)柱體積。然后，合并20%乙醇部分，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.28，分3次經(jīng)反相MPLC柱層析（柱體積為10 L），依次用5%、28%、40%乙醇分

別洗脫1、4、5個(gè)柱體積，液相跟蹤檢測(cè)后，得到6個(gè)流份（Fr.1～Fr.6）。其中，F(xiàn)r.2主要含原薯蕷皂苷粗品，將其減壓濃縮，上制備液相柱 （100 mm×250 mm，10μm），依次用25%、32%、70%乙腈洗脫，液相跟蹤檢測(cè)后合并目標(biāo)流份，根據(jù)其情況 （主要是顏色）采用制備液相色譜儀與樹(shù)脂色譜柱 （100 mm×250 mm，10μm）分離，從而得到純品，再經(jīng)HPLC柱層析（100 mm×250 mm，10μm）處理。結(jié)果，在乙腈-水 （25∶75、29∶71、32∶68）條件下，分別得到化合物1（263.4 mg）、2（375.4 mg）、3（305.4 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，Liebermann-Burchard、Molish及Ehrlish反應(yīng)均呈陽(yáng)性，香草醛反應(yīng)顯黃色，提示為呋甾皂苷類化合物，并且酸水解檢出葡萄糖和鼠李糖。ESI-MS m/z：1 069.2［M+Na］+、1 045.4［M-H］-、899.2［M-H-146］-、753.2［MH-146-146］-、737.7［M-H-146-162］-、591.3［M-H-146-146-162］-，表明含有1個(gè)葡萄糖和2個(gè)鼠李糖，分子量為1 046，分子式為C51H82O22。1HNMR（400 MHz，C5D5N）δ：0.64（3H，s，H-18），1.66（3H，s，H-21），0.95（3 H，s，H-19），1.06（3H，d，J=5.6 Hz，H-27），4.66（1H，d，J=6.8 Hz，H-1 of 26-0-Glc），4.72（1H，d，J=6.4 Hz，H-1 of Glc［inner］），5.24（1H，brs，H-6），5.65（1H，brs，H-1 of Rha［1→4］），6.19（1H，brs，H-1 of Rha［1→2］），1.63（3H，d，J=4.8 Hz，H-6 of Rha［1→2］），1.48（3H，d，J=4.8 Hz，H-6 of Rha［1→4］）。將其13C-NMR譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［6］報(bào)道的偽原薯蕷皂苷比較，發(fā)現(xiàn)其C-23位碳信號(hào)向低場(chǎng)位移了30.3（α效應(yīng)），C-24位向低場(chǎng)位移了10.9（β效應(yīng)），而C-25位向高場(chǎng)位移了0.6（γ效應(yīng)），表明C-23位上有羥基取代，受其影響，C-20和C-22的化學(xué)位移也稍有變化，分別為104.9和154.4。在HMBC譜中，δH1.06（H-27）與δC39.7（C-24）、31.0（C-25）、75.5（C-26）均有明顯相關(guān)，進(jìn)一步確定其羥基連在C-23上。此外，δH1.66（CH3-21）與 δC64.9（C-17）、104.9（C-20）、154.4（C-22）也均有遠(yuǎn)程相關(guān)，表明雙鍵連接在C-20和C-22上。以上所有13C-NMR譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，而且與文獻(xiàn) ［8］報(bào)道基本一致，鑒定為黃山藥皂苷H（dioscoreside H），其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

化合物2：白色粉末，Liebermann-Burchard、 Molish及Ehrlish反應(yīng)均呈陽(yáng)性，香草醛反應(yīng)顯黃色，提示為呋甾皂苷類化合物，而且酸水解檢出葡萄糖和鼠李糖。ESI-MS m/z：1 087.1［M+Na］+、1 062.9［M-H］-、916.5［M-H-146］-、754.4［MH-146-162］-、738.2［M-H-162-162］-、592.2［M-H-162-146-162］-、430.4［M-H-162-146-162-162］-，表明含有3個(gè)葡萄糖和1個(gè)鼠李糖，分子量為1 064，分子式為C51H84O23。1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δ：0.79（3H，s，H-18），0.88（3H，d，J=6.0 Hz，H-27），0.96（3H，s，H-19），1.22（3H，d，J=6.4 Hz，H-21），4.81（1H，d，J=7.2 Hz，H-1 of 26-0-Glc），5.24（1H，brs，H-6），4.79（1H，d，J=7.2 Hz），4.96（1 H，d，J=7.8 Hz），5.10（1H，d，J= 7.0 Hz），6.38（1H，s），1.62（3H，d，J=6.0 Hz，H-6 of Rha［1→2］）。以上所有13C-NMR譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，然后用β-D-葡萄糖苷酶對(duì)其進(jìn)行酶解，得到纖細(xì)薯蕷皂苷和β-D-葡萄糖。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［9］報(bào)道基本一致，鑒定為原纖細(xì)薯蕷皂苷（protograllin），其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

Fig.2 化合物1～3的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of com pounds1-3

化合物3：白色粉末，Liebermann-Burchard、Molish及Ehrlish反應(yīng)均呈陽(yáng)性，香草醛反應(yīng)顯黃色，提示為呋甾皂苷類化合物，而且酸水解檢出葡萄糖和鼠李糖。ESI-MS m/z：925.1［M+Na］+、

901.1［M-H］-、755.1［M-H-146］-、593.2［MH-146-162］-、431.2［M-H-162-146-162］-，表明含有2個(gè)葡萄糖和1個(gè)鼠李糖，分子量為902，分子式為C45H74O18。1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δ：0.80（3H，s，H-18），0.89（3H，d，J=6.4 Hz，H-27），0.83（3H，s，H-19），1.21（3H，d，J= 6.8 Hz，H-21），5.21（1 H，brs，H-6），4.82（1H，d，J=7.2 Hz，H-1 of Glc［inner］），4.79（1H，d，J=7.5 Hz），5.72（1H，brs，H-1 of Rha［1→4］），1.59（3H，d，J=6.4 Hz，H-6 of Rha［1→4］）。以上所有13C-NMR譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，并且與文獻(xiàn)［10-11］報(bào)道基本一致，鑒定為26-0-β-D-吡喃葡萄糖基-（25R）-呋甾烷-5-烯-3β，22ξ，26-三醇-3-0-［α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）］-β-D-吡喃葡萄糖苷（26-0-β-D-glucopyranosyl-［25R］-furost-5-en-3β，22ξ，26-triol-3-0-［α-L-rhamnopyranosyl｛1→4｝］-β-D-glucopyranoside），其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

表1 化合物1～3的13C-NM R譜數(shù)據(jù)（400 MHz，C5D5N）Tab.113C-NMR data of com pounds1-3（400 M Hz，C5D5N）

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Isolation and identification of the im purities of protodioscin in Dioscorea nipponica M akino

ZHANG Jie1， HU Tian-yu2， SHEN Guo-liang1， YANG Yang3， GU Zheng-bing1*

（1.Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Taizhou 2253OO，China；2.Department of Pharmaceutical Engineering，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China；3.Chengxian College，Southeast University Nanjing 21OO88，China）

AIM To investigate the chemical constituents of impurities in protodioscin extracted from Dioscorea nipponica Makino.METHODS Raw protodioscin was obtained from D.nipponica extract，which was isolated and purified bymacroporous adsorption resin and preparative HPLC column.Then the structures of isolated compoundswere identified on the basis of physicochemical properties and spectroscopic data.RESULTS Three impurities were isolated and identified as dioscoreside H（1），protogracillin（2）and 26-0-β-D-glucopyranosyl-（25R）-furost-5-en-3β，22ξ，26-triol-3-0-［α-L-rhamnopyranosyl（1→4）］-β-D-glucopyranoside（3）. CONCLUSION Compounds 1 and 3 are isolated from Dioscorea nipponica Makino for the first time.

Dioscorea nipponica Makino；protodioscin；dioscoreside H；protogracillin；26-0-β-D-glucopyranosyl-（25 R）-furost-5-en-3β，22ξ，26-triol-3-0-［α-L-rhamnopyranosyl（1→4）］-β-D-glucopyranoside

R284.1

A

1001-1528（2015）12-2682-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.024

2015-04-28

張 杰 （1987—），男，碩士，研究方向?yàn)橹兴幏治龊吞烊凰幬锘瘜W(xué)。Tel：15116327288，E-mail：13478536926@163.com

*通信作者：顧正兵，男，博士，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。Tel：（0523）80183620，E-mail：zbg@youging.com