超臨界CO2萃取法與水蒸氣蒸餾法提取垂絲海棠葉揮發(fā)油成分及其抗氧化活性的比較

衛(wèi) 強(qiáng)， 李前榮， 尹 浩， 紀(jì)小影， 徐 飛

（1.安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽合肥230088；2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230026）

超臨界CO2萃取法與水蒸氣蒸餾法提取垂絲海棠葉揮發(fā)油成分及其抗氧化活性的比較

衛(wèi) 強(qiáng)1， 李前榮2， 尹 浩2， 紀(jì)小影1， 徐 飛1

（1.安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽合肥230088；2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230026）

目的 比較以超臨界CO2萃取與水蒸氣蒸餾法提取的垂絲海棠葉揮發(fā)油成分及其抗氧化活性的差別。方法 采用超臨界CO2萃取法和水蒸氣蒸餾法從垂絲海棠葉中提取揮發(fā)油，氣相色譜-高分辨質(zhì)譜 （GC-HRMS）法對(duì)其成分進(jìn)行分析，歸一法確定其相對(duì)百分含有量。結(jié)果 從超臨界CO2萃取的揮發(fā)油中鑒定出30個(gè)成分，占總離子流圖峰面積的65.72%；從水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油中鑒定出27個(gè)，占91.96%。兩種揮發(fā)油中有9種共同成分。另外，超臨界CO2萃取法所得的揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基和NaNO2的清除能力均強(qiáng)于水蒸氣蒸餾法所得的揮發(fā)油和維生素C。結(jié)論 兩種不同提取工藝下垂絲海棠葉揮發(fā)油成分的差別較大，超臨界CO2萃取中揮發(fā)油成分抗氧化活性較強(qiáng)。

垂絲海棠葉；揮發(fā)油；超臨界CO2萃??；水蒸氣蒸餾；GC-HRMS；抗氧化活性

海棠為薔薇科蘋果屬觀賞植物，其種類有西府海棠Malusmicromalus、垂絲海棠M.halliana、楸子M.prunifolia、湖北海棠M.hupehensis、三葉海棠M.sieboldii等，因其花果有觀賞價(jià)值、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)而被廣泛應(yīng)用于園林景觀中［1］。其中，垂絲海棠M.halliana koehne廣泛分布于我國(guó)華東及西南地區(qū)，其花入藥，能調(diào)經(jīng)、和血、治崩漏［2］。

在人類各種疾病中，有90%以上源于活性氧和氧化應(yīng)激，而體內(nèi)過多的氧自由基則會(huì)損害人體健康，可導(dǎo)致人體正常細(xì)胞和組織的損傷，引起多種疾病，如炎癥、輻射損傷、腫瘤、帕金森病、老年癡呆癥和心臟病等［3-4］。多糖具有廣泛的生物活性，而抗氧化作用是其抗衰老、抑腫瘤、降血脂、降血糖的作用機(jī)制之一［5］。國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，垂絲海棠等7種常見觀賞海棠果實(shí)提取物的多酚和黃酮類成分具有較強(qiáng)的抗氧化作用［6］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)垂絲海棠葉中揮發(fā)油類成分采用超臨界CO2萃取 （SFE-CO2）和水蒸氣蒸餾法提取，GC-HRMS法進(jìn)行成分分析，比較抗氧化活性，以期為其應(yīng)用開發(fā)提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

HA221-50-01型超臨界萃取設(shè)備 （江蘇南通華安超臨界萃取有限公司）；氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 （英國(guó)Micromass公司）；FA1004型電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；101A-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱 （上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；FY130型中藥粉碎機(jī) （天津泰斯特儀器有限公司）；揮發(fā)油測(cè)定器 （合肥三元化玻儀器公司）。所用試劑均為分析純 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為蒸餾水。垂絲海棠葉采自安徽合肥大蜀山地區(qū)，經(jīng)安徽新華學(xué)院劉金旗副教授鑒定為垂絲海棠Malus halliana koehne的莖上葉。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 揮發(fā)油的提取

2.1.1 超臨界流體萃取 稱取垂絲海棠葉粗粉50 g，置于萃取釜中 （壓力20 MPa；溫度40℃；萃取時(shí)間120 min；分離釜Ⅰ壓力15 MPa，溫度為40℃；分離釜Ⅱ壓力8MPa，溫度35℃）。萃取物經(jīng)減壓蒸餾得揮發(fā)油，呈淺綠色，提取三次，以油重/樣品重測(cè)得平均收率為2.10%。

2.1.2 水蒸氣蒸餾法 稱取垂絲海棠葉粗粉50 g，按 《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄XD揮發(fā)油測(cè)定方法進(jìn)行操作，連續(xù)蒸餾6 h，收集揮發(fā)油，均呈淺綠色，提取三次，以油重/樣品重測(cè)得平均收率為1.87%。

2.2 GC-MS測(cè)定參數(shù) Agilent DB-5MS色譜柱（30 mm× 0.25 mm，0.25μm）；載氣為高純氦氣；體積流量 1 m L/m im；進(jìn)樣量2μL；分流比10：1；氣化溫度280℃；GC-MS接口溫度280℃；GC升溫程序?yàn)槌跏?0℃，恒溫0.5 m in，以8℃/min速率升至280℃，保持10m in；EI電離方式；電子能量70 eV；分辨率7 000 FWHM；離子源溫度220℃；EI收集電流250μA；內(nèi)標(biāo)為全氟三丁基胺；m/z218.985 6處作單點(diǎn)鎖定矯正精確質(zhì)量。軟件包括13

萬張標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖NIST庫的檢索功能。

2.3 揮發(fā)油化學(xué)成分分析 對(duì)總離子流圖中各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后，得到質(zhì)譜圖，通過工作站NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫進(jìn)行檢索，確認(rèn)各化合物。然后，經(jīng)工作站數(shù)據(jù)系統(tǒng)處理，按峰面積歸一化法計(jì)算各化合物在揮發(fā)油中的百分含有量。

2.4 垂絲海棠葉揮發(fā)油的抗氧化活性測(cè)定

2.4.1 垂絲海棠葉揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基清除作用的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn) ［7-8］，分別取超臨界CO2和水蒸氣蒸餾法提取的垂絲海棠葉揮發(fā)油20～100μL，置于5支試管中，加丙酮至100μL。再分別加入質(zhì)量濃度為24 mg/L的DPPH 95%乙醇溶液5 mL，避光反應(yīng)2 h后，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸收度（Ai），以DPPH 95%乙醇溶液為空白對(duì)照，測(cè)定對(duì)照組吸光度（A0），以1 mg/m L維生素C（Vc）為陽性對(duì)照，按如下公式計(jì)算清除率。

清除率=（1-Ai/A0）×100%

2.4.2 垂絲海棠葉揮發(fā)油對(duì)NaNO2清除作用的測(cè)定 取質(zhì)量濃度為0.5 mol/L的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液（pH為3.0）5.0 mL，置于10 mL量瓶中，分別加入0.1 g/L的NaNO2溶液1mL、超臨界CO2和水蒸氣蒸餾法提取的垂絲海棠葉揮發(fā)油各20～100μL，蒸餾水定容，搖勻，于37℃下反應(yīng)1 h。再精密移取反應(yīng)液1 mL，加入質(zhì)量濃度為4 g/L的對(duì)氨基苯磺酸溶液2 mL和質(zhì)量濃度為2 g/L的N-1-萘乙二胺鹽酸鹽溶液1 m L，搖勻，靜置10 min，在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)x，以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，測(cè)定吸光度A0，以1 mg/mL維生素C（Vc）為陽性對(duì)照，按如下公式計(jì)算清除率。

清除率=［（A0-Ax）/A0］×100%

3 結(jié)果

3.1 揮發(fā)油化學(xué)成分分析 超臨界CO2萃取、水蒸氣蒸餾法提取垂絲海棠葉揮發(fā)油的氣相色譜圖見圖1、圖2，GCMS法分離鑒定出其中的揮發(fā)性成分見表1和表2。由圖可知，SFE-CO2萃取所得的垂絲海棠葉揮發(fā)油中已鑒定成分占總離子流圖峰面積的65.72%，而水蒸氣蒸餾所得的垂絲海棠葉揮發(fā)油中已鑒定成分占91.96%。揮發(fā)油主要由萜類、芳香族、脂肪族化合物等組成，通過對(duì)兩種方法所得的垂絲海棠葉揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SFE-CO2萃取法揮發(fā)油中萜類成分有26種，占83.87%，芳香族成分有2種，占6.45%，脂肪族成分有3種，占9.68%；水蒸氣蒸餾法揮發(fā)油中萜類成分有24種，占85.71%，芳香族成分有3種，占10.71%，脂肪族成分有1種，占3.57%。

由表可知，SFE-CO2萃取和水蒸氣蒸餾法所得的垂絲海棠葉揮發(fā)油中，含有9種共同化學(xué)成分，分別為1，8-桉葉素、馬鞭烯醇、樟腦、龍腦、反式乙酸菊烯酯、β-順式金合歡烯、柏木烯、β-柏木烯、表藍(lán)桉醇。其中，反式乙酸菊烯酯含有量較高，分別為25.02%、60.46%。

圖1 垂絲海棠葉揮發(fā)油（SFE-CO2萃取）的總離子流圖

圖2 垂絲海棠葉揮發(fā)油 （水蒸氣蒸餾）的總離子流圖

表1 垂絲海棠葉揮發(fā)油（SFE-CO2萃?。└叻直尜|(zhì)譜數(shù)據(jù)

3.2 垂絲海棠葉揮發(fā)油的抗氧化活性測(cè)定

3.2.1 垂絲海棠葉揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除作用（圖3）由圖可知，垂絲海棠葉揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基有一定的清除作用，當(dāng)其體積達(dá)到100μL時(shí)，清除率最大。其中，SFE-CO2法所得揮發(fā)油的清除率為72.8%，高于1mg/mL Vc，而水蒸氣蒸餾所得揮發(fā)油的清除率為62.6%，低于1 mg/mL Vc。揮發(fā)油和Vc對(duì)DPPH自由基的清除率與樣品體積呈正相關(guān)，垂絲海棠葉揮發(fā)油 （SFE-CO2）、垂絲海棠葉揮發(fā)油 （水蒸氣蒸餾）、Vc樣品體積（Y）與清除率（X）的回歸方程分別為Y= 0.474X+28.43，r=0.985、Y=0.464X+22.43，r=0.993、Y= 0.559X+5.13，r=0.968。當(dāng)清除率為50%時(shí)，三者的體積分別為45.51、59.42、80.27μL。

表2 垂絲海棠葉揮發(fā)油 （水蒸氣蒸餾）高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)

圖3 垂絲海棠葉揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除作用

3.2.2 垂絲海棠葉揮發(fā)油對(duì)NaNO2的清除作用 （圖4）由圖可知，垂絲海棠葉揮發(fā)油對(duì)NaNO2有一定的清除作用，當(dāng)其體積達(dá)到100μL時(shí)，水蒸氣蒸餾、SFE-CO2所得揮發(fā)油的清除率均高于1 mg/mL Vc，分別為80.1%、69.8%。垂絲海棠葉揮發(fā)油 （SFE-CO2）、垂絲海棠葉揮發(fā)油 （水蒸氣蒸餾）、Vc樣品體積 （Y）與清除率 （X）的回歸方程分別為Y=0.384X+41.23，r=0.990、Y=0.539X+ 17.93，r=0.989、Y=0.314X+36.83，r=0.978。當(dāng)清除率為 50%時(shí)，三者的體積分別為 22.84、59.50、41.94μL。

4 討論

SFE-CO2萃取的垂絲海棠葉揮發(fā)油中主要含反式乙酸菊烯酯、乙酸龍腦酯、大牻牛兒烯-D、馬鞭烯醇、柏木烯、西車烷、3，15-dideacetylcalonectrin，占41.14%，而水蒸氣蒸餾提取的垂絲海棠葉揮發(fā)油中主要含乙酸菊烯酯、馬鞭烯醇、樟腦、1，5-diisopropenyl-4-（1-methylprop-2-enyl）cyclohexene、石竹烯、α-柏木烯、β-柏木烯，占78.87%。其中，乙酸菊烯酯為鵝不食草揮發(fā)油中的主要成分［9-10］，可用于治療治療急、慢性鼻炎引起的鼻塞，頭痛腦脹［11］；乙

圖4 垂絲海棠葉揮發(fā)油對(duì)NaNO2的清除作用

酸龍腦酯具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用［12］；石竹烯具有局部麻醉、治療結(jié)腸炎、空氣清潔作用［13］。另外，SFE-CO2萃取的揮發(fā)油中含不飽和雙鍵的萜類成分占83.87%，它具有抗氧化功能［14］，可能是其強(qiáng)抗氧化活性的內(nèi)在原因。

SFE-CO2萃取和水蒸氣蒸餾法所得的垂絲海棠葉揮發(fā)油中均含有1，8-桉葉素、馬鞭烯醇、樟腦、龍腦、反式乙酸菊烯酯、β-順式金合歡烯、柏木烯、β-柏木烯、表藍(lán)桉醇這9種成分。其中，反式乙酸菊烯酯在兩種揮發(fā)油中均具有較高的含有量，分別為25.02%、60.46%。

自由基是機(jī)體代謝的中間產(chǎn)物，普遍存在于人體內(nèi)，通常為最外層電子軌道上的未成對(duì)電子、獨(dú)立存在原子、原子團(tuán)、分子或離子［15］。1956年，Denham Harman提出衰老的自由基學(xué)說，認(rèn)為衰老過程導(dǎo)致的退行性改變是由于細(xì)胞代謝產(chǎn)生的自由基引起的，它可誘發(fā)DNA損傷、突變、腫瘤形成，氧化細(xì)胞中的多種物質(zhì)可損害生物膜，使蛋白質(zhì)、核酸等大分子發(fā)生交聯(lián)，從而產(chǎn)生功能異常，而機(jī)體抗氧化能力的提高能對(duì)抗活性氧引發(fā)的各種疾病［16-17］。DPPH自由基清除率測(cè)定法廣泛應(yīng)用于定量測(cè)定生物試樣、各類物質(zhì)和食品的抗氧化能力，具有快速、易重復(fù)、簡(jiǎn)單、靈敏、不需要復(fù)雜儀器等優(yōu)點(diǎn)。另外，國(guó)內(nèi)研究表明，在胃部酸性條件下，亞硝酸鹽與胺類同時(shí)存在時(shí)將形成亞硝胺，它是公認(rèn)的三大強(qiáng)致癌物之一［18］，而低劑量亞硝酸鈉可促進(jìn)人肝癌MMC-7721細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡［19］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，超臨界CO2萃取的揮發(fā)油在抗氧化活性上優(yōu)于水蒸氣蒸餾，推測(cè)可能是由于水蒸氣提取時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6 h，而且在高溫下加熱，成分破壞嚴(yán)重，影響了其活性作用。

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R284.2

B

1001-1528（2015）11-2550-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.051

2014-07-28

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目 （AH201412216010，201412216008）；安徽省質(zhì)量工程項(xiàng)目 （2013gxk105）；安徽新華學(xué)院質(zhì)量工程項(xiàng)目（2013gxkcx01）

衛(wèi) 強(qiáng)（1977-），男，碩士，副教授，從事藥學(xué)教學(xué)與科研工作。E-mail：weiqiang509@sina.com