布地奈德對哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞閉鎖蛋白表達(dá)的影響*

游曼清，鄧俊，梁宇佳，熊瑛，熊彬，王宋平

（1.四川省樂山市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 樂山 614000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸一科，四川 瀘州 646000）

·論著·

布地奈德對哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞閉鎖蛋白表達(dá)的影響*

游曼清1，鄧俊2，梁宇佳2，熊瑛2，熊彬2，王宋平2

（1.四川省樂山市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 樂山 614000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸一科，四川 瀘州 646000）

目的觀察哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞閉鎖蛋白的表達(dá)及布地奈德對其表達(dá)的影響。方法將24只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為哮喘模型組、布地奈德組及對照組，每組8只。對照組用生理鹽水，哮喘模型組和布地奈德組用卵清蛋白腹腔注射致敏及霧化吸入激發(fā)建立哮喘模型，布地奈德組每次激發(fā)前1 h吸入布地奈德混懸液1 mg，連續(xù)14 d。對照組和哮喘模型組用等量生理鹽水代替布地奈德，吸入方法和時(shí)間同布地奈德組。小鼠末次激發(fā)24 h后，計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的嗜酸性粒細(xì)胞（EOS），HE和PAS染色觀察支氣管及周圍肺組織的病理改變、杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌；電鏡觀察氣道上皮的超微結(jié)構(gòu)；免疫組織化學(xué)和熒光定量PCR檢測氣道上皮occludin的表達(dá)。結(jié)果與對照組比較，哮喘模型組小鼠BALF中EOS計(jì)數(shù)、氣道上皮杯狀細(xì)胞數(shù)及病理學(xué)評分明顯增高；支氣管肺組織occludin蛋白表達(dá)明顯減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與哮喘模型組比較，布地奈德組EOS和杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)及病理學(xué)評分明顯降低，occludin蛋白表達(dá)增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。哮喘模型組氣道上皮細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞間隙增寬，而布地奈德組上述表現(xiàn)較哮喘組減輕。結(jié)論布地奈德能上調(diào)哮喘小鼠氣道上皮occludin的表達(dá)、促進(jìn)受損氣道上皮的修復(fù)，可能是吸入型糖皮質(zhì)激素治療哮喘的機(jī)制之一。

布地奈德；哮喘；氣道上皮細(xì)胞；緊密連接；閉鎖蛋白

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種氣道慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。近年來隨著對哮喘研究的逐漸深入，人們認(rèn)識到氣道上皮細(xì)胞及其屏障功能受損可能在哮喘發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[1-2]。氣道上皮細(xì)胞之間的連接由緊密連接、黏附連接和縫隙連接共同組成，是氣道上皮屏障的主要組成部分，其中較為重要的是緊密連接[3]。閉鎖蛋白（occludin）是首先被發(fā)現(xiàn)的緊密連接相關(guān)蛋白，在細(xì)胞間緊密連接的形成中起著重要作用，但氣道上皮occludin的表達(dá)變化與哮喘發(fā)病的關(guān)系尚缺乏深入研究[4]。霧化吸入糖皮質(zhì)激素是目前治療哮喘最有效的方法之一，而布地奈德是臨床上普遍應(yīng)用的吸入型激素。本研究旨在觀察occludin在哮喘小鼠氣道上皮的表達(dá)及吸入布地奈德對其表達(dá)的影響，探討occludin在哮喘發(fā)病中的作用及吸入型糖皮質(zhì)激素治療哮喘的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、氫氧化鋁干粉（Sigma公司），兔抗鼠occludin多克隆抗體（博奧森公司），HRP山羊抗兔二抗（康成生物公司），RNA提取試劑盒（Tiangen Biotech公司），引物合成（上海生物工程有限公司），DAB顯色試劑盒（R&D公司），2×Taq PCR Master Mix試劑盒，Rea Master Mix（SYBR GreenⅠ）熒光定量試劑盒（Tiangen公司），SP試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及哮喘模型的制備將24只雌性BALB/c小鼠用隨機(jī)數(shù)字表法分成哮喘組、布地奈德組及對照組，每組8只。哮喘組：0、7及14 d腹腔注射OVA+氫氧化鋁的生理鹽水混懸溶液0.2 ml（含OVA 20μg，氫氧化鋁2 mg）致敏，第21天起給予1%OVA霧化激發(fā)30 min，1次/d，連續(xù)14 d。每次激發(fā)前1 h霧化吸入生理鹽水2 ml。布地奈德組：致敏及激發(fā)同哮喘組，但每次激發(fā)前1 h霧化吸入布地奈德混懸液1 mg（2 ml）。對照組：用相同的方法以生理鹽水代替OVA進(jìn)行致敏和激發(fā)。

1.2.2支氣管肺泡灌洗液（BALF）嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)小鼠末次激發(fā)24 h后腹腔注射1%戊巴比妥鈉0.2 ml麻醉，剖開胸腔，結(jié)扎右側(cè)主支氣管，以1 ml生理鹽水灌洗左肺，每只小鼠重復(fù)灌洗3次，收集灌洗液離心，取細(xì)胞懸液涂片、染色，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophies，EOS）。

1.2.3支氣管肺組織HE與PAS染色取右上肺組織于4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，厚度5μm。HE染色光鏡下觀察支氣管及其周圍組織的病理改變，PAS染色觀察氣道黏膜上皮層杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌情況。氣道上皮杯狀細(xì)胞增生評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5]，在400倍光鏡下每只小鼠隨機(jī)選擇10個(gè)氣道，計(jì)數(shù)PAS染色陽性的杯狀細(xì)胞積分（無杯狀細(xì)胞為0分，＜25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，≥75%為4分），所有杯狀細(xì)胞積分取平均值。

1.2.4電鏡觀察氣道上皮超微結(jié)構(gòu)取右肺中葉切成1 mm×1 mm×1 mm大小置于裝有25%戊二醛的EP管中固定，磷酸緩沖液漂洗，1%鋨酸固定，蒸餾水漂洗，脫水，1∶1的包埋液+丙酮常溫滲透，100%包埋液滲透，包埋，沉降，聚合，切片，厚度60 nm，行鏡檢。

1.2.5免疫組織化學(xué)方法檢測occludin的表達(dá)取右下肺組織用4%多聚甲醛溶液固定，制備3μm石

蠟切片，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（SP）行免疫組織化學(xué)染色，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，兔抗小鼠occludin多克隆抗體以1∶400稀釋。陽性染色為氣道上皮細(xì)胞表面和細(xì)胞間的包膜上黃色或棕黃色染色，說明有occludin表達(dá)，同時(shí)設(shè)置陰性對照。圖像用Motic Fluo 1.0軟件分析，在相同放大倍數(shù)（×400）下，每張切片隨機(jī)選6個(gè)氣道視野，測定其光密度（optical density，OD）值。1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測肺組織occludin mRNA表達(dá)取右下肺組織，每份樣品取約50 mg，充分研磨，加入1ml Trizol提取總RNA并合成cDNA，再PCR擴(kuò)增。Occludin引物序列5'-AAGAGTACAT GGCTGCTGCT-3'為上游引物，5'-TTTGCCTCTGGA GAGAATTG-3'為下游引物，此對引物擴(kuò)增出230 bp片段。以β-actin為內(nèi)參照，上游引物為5'-AATGG GTCAGAAGGACTCCT-3'，下游引物為5'-ACGGTTG GCCTTAGGGTTCAG-3'，此對引物擴(kuò)增出250 bp片段。反應(yīng)條件（95℃2 min，95℃5 s，55.7℃20 s，72℃15 s，共40個(gè)循環(huán)，在循環(huán)第2步采集熒光）。反應(yīng)結(jié)束后記錄Ct值（基本循環(huán)數(shù)），算出ΔCt（基本循環(huán)與內(nèi)參循環(huán)數(shù)差值）和ΔΔCt（最低樣本ΔCt值-其他各樣本ΔCt值），計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)量RQ值（occludin mRNA/β-actin mRNA即RQ值=2-ΔΔCt）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，每組樣本均數(shù)經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)后，單因素方差分析用于組間比較，SNK檢驗(yàn)用于組間兩兩之間的比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1BALF中EOS計(jì)數(shù)

與對照組EOS計(jì)數(shù)（0.750±0.707）比較，哮喘組EOS計(jì)數(shù)（20.875±1.808）顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；布地奈德組EOS計(jì)數(shù)（10.625± 1.302）明顯低于哮喘組，但仍高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2支氣管肺組織HE染色結(jié)果

哮喘組小鼠氣道上皮脫落不完整，氣道黏膜層有大量炎癥細(xì)胞浸潤，黏液腺增生，黏膜下水腫，黏膜下層增寬，氣道壁及氣道平滑肌增厚，管腔狹窄，部分氣道管腔內(nèi)可見黏液栓；布地奈德組病理改變較哮喘組減輕；對照組未見上述病理改變。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化（HE×200）

2.3PAS染色結(jié)果

哮喘組小鼠氣道上皮PAS染色陽性的杯狀細(xì)胞胞漿染成紫紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色，可見大量杯狀細(xì)胞增生，管腔內(nèi)見大量染成紫紅色的黏液；布地奈德組杯狀細(xì)胞增生減少，管腔內(nèi)見少量黏液；對照組未見明顯杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌。與對照組杯狀細(xì)胞積分（0.250±0.463）比較，哮喘組氣道上皮PAS染色陽性的杯狀細(xì)胞積分（3.375±0.744）明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；布地奈德組杯狀細(xì)胞積分（1.625±0.518）明顯低于哮喘組，但仍高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

2.4電鏡觀察氣道上皮的超微結(jié)構(gòu)

對照組小鼠氣道上皮纖毛完整，無脫落，微絨毛較多，結(jié)構(gòu)清晰，上皮細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞緊密排列，基底膜完整；哮喘組氣道上皮纖毛明顯脫落、變稀、變短，微絨毛減少，細(xì)胞頂端呈泡狀膨大，

上皮細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)有松裂或缺失，細(xì)胞間隙增寬，基底膜不連續(xù)；布地奈德組上述表現(xiàn)較哮喘組減輕。見圖3。

圖2 各組小鼠肺組織PAS染色（PAS×200）

圖3 各組小鼠氣道上皮的超微結(jié)構(gòu)（×12 000）

2.5免疫組織化學(xué)檢測氣道上皮occludin的表達(dá)

對照組小鼠氣道上皮occludin主要在氣道上皮細(xì)胞表面和細(xì)胞間的包膜上呈線性表達(dá)，陽性染色為黃色或棕黃色染色。布地奈德組小鼠氣道上皮occludin表達(dá)較對照組明顯減弱，但仍比哮喘組表達(dá)顯著，見圖4。哮喘組occludin的OD值（0.126± 0.032）低于對照組（0.652±0.313）及布地奈德組（0.337±0.028），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與對照組比較，布地奈德組的OD值仍減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4 各組小鼠氣道occludin的表達(dá)（SP法×400）

2.6肺組織occludin mRNA的表達(dá)

目的基因的融解曲線為單峰曲線，融解溫度均一，峰的形狀較尖銳（見圖5），表明無非特異性產(chǎn)物

及引物二聚體生成，引物特異性良好，退火溫適中。各樣品occludin mRNA的相對表達(dá)量（RQ值）見圖6，3組小鼠occludin mRNA的RQ值分別為（7.200± 4.959）、（3.127±2.030）和（4.772±1.848），組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.960，P＞0.05）。

圖5 目的基因的溶解曲線圖

圖6 各樣品occludin mRNA的RQ值

3 討論

氣道上皮屏障是支氣管肺組織抵御外界環(huán)境有害刺激的第一道屏障，由氣道上皮表面液和上皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞間的連接構(gòu)成，緊密連接作為細(xì)胞間連接的主要形式，位于氣道上皮細(xì)胞的頂端和細(xì)胞間的側(cè)膜上，是維持氣道上皮屏障功能正常的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[6]。Occludin是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的緊密連接相關(guān)蛋白，是緊密連結(jié)結(jié)構(gòu)的主要功能調(diào)節(jié)蛋白，通過封閉細(xì)胞間隙，調(diào)節(jié)細(xì)胞旁滲透性[4]。氣道上皮細(xì)胞通過細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)阻擋環(huán)境中的變應(yīng)原、粉塵、病毒等入侵，而這層結(jié)構(gòu)的缺陷可導(dǎo)致各種環(huán)境激發(fā)因子和炎癥細(xì)胞更快速地通過氣道上皮屏障[7]。本實(shí)驗(yàn)不僅觀察到哮喘小鼠氣道上皮有大量炎癥細(xì)胞浸潤，黏液腺增生，氣道壁及氣道平滑肌增厚，管腔狹窄等病理改變，而且通過電鏡觀察還發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)有松裂、缺失，細(xì)胞間隙增寬，基底膜不連續(xù)的現(xiàn)象。DE等[8]研究也發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的支氣管活檢組織中氣道上皮緊密連接相關(guān)蛋白α連環(huán)素、ZO-1和E-鈣黏蛋白的表達(dá)較非哮喘患者明顯降低，氣道上皮間的緊密連接結(jié)構(gòu)有缺失，哮喘患者氣道上皮屏障的缺失導(dǎo)致環(huán)境激發(fā)因子更加容易入侵和嗜酸性粒細(xì)胞在氣道上皮的浸潤。本實(shí)驗(yàn)不僅發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠氣道上皮緊密連接結(jié)構(gòu)遭受破壞，還觀察到哮喘組小鼠氣道上皮細(xì)胞occludin蛋白表達(dá)較正常對照組明顯減弱，但occludin mRNA表達(dá)在3組小鼠之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。XIAO等[9]在哮喘患者氣道上皮細(xì)胞occludin表達(dá)的研究中也得到同樣的結(jié)果。這也許是occludin在哮喘小鼠或哮喘患者氣道上皮表達(dá)的減少與蛋白的翻譯有關(guān)，而與蛋白的轉(zhuǎn)錄無關(guān)。本研究結(jié)果提示，氣道上皮屏障結(jié)構(gòu)的破壞與occludin表達(dá)的降低可能是哮喘發(fā)病的病理基礎(chǔ)之一。

布地奈德是目前臨床上普遍用于治療哮喘的吸入型糖皮質(zhì)激素，能減輕氣道炎癥，有效治療哮喘[10]。既往的研究表明，吸入糖皮質(zhì)激素主要通過抑制EOS等炎癥細(xì)胞在氣道的募集和活性，抑制炎癥介質(zhì)的生成和釋放，增強(qiáng)氣道平滑肌細(xì)胞β2腎上腺素受體的反應(yīng)性等機(jī)制發(fā)揮抗炎作用[11-12]。本研究結(jié)果也顯示，霧化吸入布地奈德能抑制哮喘小鼠氣道上皮EOS浸潤、抑制杯狀細(xì)胞增生和黏液腺分泌，減輕氣道黏膜充血水腫等炎癥反應(yīng)。但糖皮質(zhì)激素對哮喘氣道上皮細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)及occludin的表達(dá)有何影響，至今尚不清楚。SEKIYAMA等[13]的研究觀察地塞米松對體外培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞屏障功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地塞米松能促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞間緊密連接的形成，降低上皮細(xì)胞的通透性，改善氣道上皮的屏障功能。本實(shí)驗(yàn)顯示，霧化吸入布地奈德后，氣道上皮細(xì)胞occludin的表達(dá)較哮喘組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。電鏡下觀察到布地奈德組小鼠氣道上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞也較哮喘組減輕。提示布地奈德能上調(diào)哮喘小鼠氣道上皮occludin的表達(dá)，促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)的修復(fù)，這也許是布地奈德治療哮喘的另一藥理機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，哮喘小鼠氣道上皮屏障結(jié)構(gòu)的不完整和occludin表達(dá)的降低，可能是哮喘發(fā)病和病情進(jìn)展的機(jī)制之一，而布地奈德能上調(diào)氣道上皮occludin的表達(dá)和促進(jìn)受損氣道上皮的修

復(fù)，該研究結(jié)果為臨床上霧化吸入布地奈德治療哮喘提供了新的理論依據(jù)。

[1]GEOR AS SN,REZAEE F.Epithelial barrier function:at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation [J].J Allergy Clin Immunol,2014,134(3):509-520.

[2]HEIJINK IH,NAWIJN MC,HACKETT TL.Airway epithelial barrier function regulates the pathogenesis of allergic asthma[J]. Clin Exp Allergy,2014,44(5):620-630.

[3]REZAEE F,GEORAS SN.Breaking barriers.New insights into airway epithelial barrier function in health and disease[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2014,50(5):857-869.

[4]CUMMINS PM.Occludin:one protein,many forms[J].Mol Cell Biol,2012,32(2):242-250.

[5]KHAKZAD MR,MIRSADRAEE M,MOHAMMADPOUR A,et al.Effect of verapamil on bronchial goblet cells of asthma:an experimental study on sensitized animals[J].Pulm Pharmacol Ther, 2012,25(2):163-168.

[6]游曼清,王宋平.氣道上皮屏障在哮喘防御機(jī)制中的研究進(jìn)展[J].國際呼吸雜志,2013,33(17):1338-1342.

[7]PROUD D,LEIGH R.Epithelial cells and airway diseases[J]. Immunol Rev,2011,242(1):186-204.

[8]DE BW,SHARMA HS,BAELEMANS SM,et al.Altered expression of epithelial junctional proteins in atopic asthma:possible role in inflammation[J].Can J Physiol Pharmacol,2008,86(3): 105-112.

[9]XIAO C,PUDDICOMBE SM,FIELD S,et al.Defective epithelial barrier function in asthma[J].J Allergy Clin Immunol,2011, 128(3):549-556.

[10]CHIAN CF,TSAI CL,WU CP,et al.Five-day course of budesonide inhalation suspension is as effective as oral prednisolone in the treatment of mild to severe acute asthma exacerbations in adults[J].Pulm Pharmacol Ther,2011,24(2):256-260.

[11]SZEFLER SJ,CARLSSON LG,URYNIAK T,et al.Budesonide inhalation suspension versus montelukast in children aged 2 to 4 years with mild persistent asthma[J].J Allergy Clin Immunol Pract,2013,1(1):58-64.

[12]BEASLEYR,WEATHERALLM,SHIRTCLIFFEP,etal. Combination corticosteroid/β-agonist inhaler as reliever therapy: a solution for intermittent and mild asthma[J]J Allergy Clin Immunol,2014,133(1):39-41.

[13]SEKIYAMA A,GON Y,TERAKADO M,et al.Glucocorticoids enhance airway epithelial barrier integrity[J].Int Immunopharmacol,2012,12(2):350-357.

（張蕾 編輯）

Effect of Budesonide on expression of occludin in airway epithelium of asthmatic mice*

Man-qing YOU1,Jun DENG2,Yu-jia LIANG2,Ying XIONG2, Bin XIONG2,Song-ping WANG2
(1.Department of Respiratory Diseases,the People's Hospital of Leshan,Leshan,Sichuan 614000,P.R.China;2.Department of Respiratory Diseases,the Affiliated Hospital, Luzhou Medical College,Luzhou,Sichuan 646000,P.R.China)

【Objective】To observe the expression of occludin in airway epithelium of asthmatic mice and effect of Budesonide on its expression.【Methods】Totally 24 female BALB/c mice were randomly divided into asthma group,Budesonide group and control group with 8 mice in each group.Asthmatic mouse model was established by intraperitoneal injection and atomized inhalation of ovalbumin.Mice in the Budesonide group were treated with aerosolized Budesonide 1 mg each time 1 h before ovalbumin provocation for 14 consecutive days.Eosinophils(EOS)in BALF were counted.HE and PAS staining was used to observe the pathological

Budesonide;asthma;airway epithelium;tight junction;occludin

R562.25；R-332

A

1005-8982（2015）27-0008-06

2014-12-03

四川省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目（No：110341）

王宋平，E-mail：wang4816@sina.com；Tel：0830-3165321

changes,goblet cell proliferation and mucus secretion in bronchial and lung tissues.The ultrastructure of airway epithelium was observed by electron microscope.The expression of occludin in airway epithelium was measured with immunohistochemical method and real-time PCR.【Results】Compared with the normal control group,the asthma group showed significant increases of EOS,goblet cells and mucus secretion,and a decrease of occludin protein expression in bronchial and lung tissues(P＜0.01).However,the Budesonide group showed fewer EOS and goblet cells,less mucus secretion and higher expression of occludin protein in bronchial and lung tissues as compared with the asthma group(P＜0.01).Electron microscope showed incomplete intercellular junction between airway epithelial cells in the asthma group,but Budesonide alleviated the above changes.【Conclusions】Budesonide could up-regulate the expression of occludin in airway epithelium of asthmatic mice,promote repair of damaged airway epithelial barrier,which might be a new mechanism of inhaled corticosteroids for treating asthma.