阿托伐他汀對小鼠壓力負荷誘導的心室重構(gòu)的保護作用及機制研究

趙地，王維，張小娟，郭偉星，趙添，姜紅菊，趙卓

基礎(chǔ)與實驗研究

阿托伐他汀對小鼠壓力負荷誘導的心室重構(gòu)的保護作用及機制研究

趙地，王維，張小娟，郭偉星，趙添，姜紅菊，趙卓

目的：觀察阿托伐他汀對小鼠主動脈弓縮窄（TAC） 術(shù)后心室重構(gòu)的保護作用并探討其可能機制。

方法：采用主動脈弓縮窄法建立小鼠心肌肥厚模型。選取48只C57BL/6小鼠，隨機分為4組（每組12只）：假手術(shù)組、TAC組、TAC＋纈沙坦組，TAC＋阿托伐他汀組，術(shù)后4 周成功造模并分別給予生理鹽水、纈沙坦（5 mg/kg）、阿托伐他汀（10 mg/kg）處理。8周后進行超聲心動圖檢查，測量左心室舒張期前壁厚度（LVAWd），左心室舒張期后壁厚度（LVPWd），左心室射血分數(shù)（LVEF）及短軸縮短率（FS），計算心肌肥厚指數(shù)。應用免疫蛋白印跡（Western blot）法檢測核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的蛋白表達水平。堿水解法檢測心肌組織羥脯氨酸（Hyp）的含量、采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）的濃度。蘇木素-伊紅（HE）染色及馬松（Masson）染色方法測定心肌膠原沉積。

結(jié)果：與假手術(shù)組相比，TAC組LVAWd、LVPWd、心肌肥厚指數(shù)、心肌纖維化面積明顯增加（P＜0.01），NF-κB的蛋白水平，Hyp含量、TNF-α、IL-1β濃度明顯升高（P＜0.01）。與TAC組相比，TAC＋阿托伐他汀組和TAC＋纈沙坦組心肌肥厚指數(shù)明顯改善， LVAWd和LVPWd減小，纖維化面積減小（P均＜0.01），NF-κB的蛋白水平，Hyp含量、TNF-α、IL-1β濃度明顯下降（P均＜0.01）。

結(jié)論：阿托伐他汀對壓力超負荷誘導的心肌肥厚有保護作用，其作用機制可能與抗炎作用有關(guān)。

阿托伐他?。粔毫ω摵?；主動脈弓縮窄術(shù)；心肌肥厚；炎癥因子

Methods: A total of 48 C57BL/6 mice were randomly divided into 4 groups: Sham group, TAC group, TAC + valsartan group and TAC + atorvastatin group, n=12 in each group. Myocardial hypertrophy model was successfully established at 4 weeks after the operation, and then the animals were further treated by normal saline, valsartan 5mg/kg and atorvastatin 10mg/kg respectively for 8 weeks. Left ventricular anterior wall thickness at diastole (LVAWd), left ventricular posterior wall thickness at diastole (LVPWd), LVEF and left ventricular fractional shortening (FS) were examined by echocardiography, cardiac hypertrophy indexes were calculated. Protein expression of NF-κB was detected by Western blot analysis, cardiac tissue hydroxyproline (Hyp) level was measured by alkaline hydrolysis, serum levels of TNF-α, IL-1β were determined by ELISA, cardiac collagen deposition was identifed by HE and Masson staining.

Results: Compared with Sham group, TAC group had increased LVAWd, LVPWd, cardiac hypertrophy indexes and increased area of cardiac fibrosis, all P＜0.01; elevated protein expressions of NF-κB, Hyp, TNF-α, IL-1β, all

P＜0.01. Compared with TAC group, TAC + valsartan group and TAC + atorvastatin group presented improved cardiac hypertrophy indexes, decreased LVAWd, LVPWd and decreased area of cardiac fbrosis, all P＜0.01; reduced protein expressions of NF-κB, Hyp, TNF-α, IL-1β, all P＜0.01.

Conclusion: Atorvastatin had protective roll on myocardial hypertrophy induced by pressure overload in experimental mice, which might be related to its anti-infammatory effect.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:1090.)

心肌肥厚（MH）是心臟維持適當收縮功能對各種病理狀態(tài)的代償反應，持續(xù)性心肌肥厚可使心肌細胞損傷纖維化，最終可導致心力衰竭[1]，及早干預心肌肥厚的發(fā)生，是延緩心力衰竭的有效手段[2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子在心肌肥厚的形成中具有重要作用[3]。而他汀類藥物具有調(diào)脂、抗炎、改善內(nèi)皮細胞功能和改善和逆轉(zhuǎn)心肌肥厚的作用[4]。本研究采用壓力負荷誘導C57BL/6小鼠建立心肌肥厚模型，探討阿托伐他汀是否通過抑制炎癥因子的表達改善心肌重構(gòu)，進一步探討他汀類藥物抑制心肌肥厚的機制。

1 材料與方法

材料與試劑：阿托伐他?。?0 mg，輝瑞制藥有限公司）。纈沙坦膠囊（80 mg，諾華制藥有限公司）。兔單克隆抗核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）抗體購于美國cell signaling technology公司。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）試劑盒由北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司提供（批號20141008）。馬松（Masson）染色試劑盒、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。

模型建立及實驗分組：選取清潔級8周齡C57BL/6雄性小鼠48只[北京華孚康生物科技實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（京）2014-0004]，飼養(yǎng)環(huán)境：山東省醫(yī)學科學院實驗室。平均室溫為（23±3）℃，每籠6只。小鼠適應環(huán)境一周后通過主動脈弓縮窄（TAC）術(shù)建立心肌肥厚模型。具體步驟如下：用異氟烷霧化吸入麻醉，仰臥位固定小鼠，胸骨正中切口，在心底部分離主動脈弓部，用 7號手術(shù)絲線將針頭和主動脈弓一齊扎緊后將針頭移去，關(guān)胸術(shù)后，依次關(guān)胸腔、肌層和皮膚，縮窄程度約為75%～80%。碘伏消毒皮膚預防感染。

48只小鼠隨機分為4組（每組12只）：假手術(shù)組、TAC組、TAC＋纈沙坦組，TAC＋阿托伐他汀組。假手術(shù)組不行主動脈弓結(jié)扎。術(shù)后4周造模成功，TAC＋纈沙坦組，TAC＋阿托伐他汀組分別給予纈沙坦和阿托伐他汀。各組小鼠體重差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

TAC＋纈沙坦組小鼠給予纈沙坦（5 mg/kg），TAC＋阿托伐他汀組給予阿托伐他?。?0 mg/kg），均溶于1 ml生理鹽水中制成懸液，采用灌胃給藥；TAC組給予生理鹽水（1.0 mg/kg）灌胃，根據(jù)小鼠體重增長情況增加給藥劑量，持續(xù)8周。

超聲心動圖檢查：TAC術(shù)后4周和8周，用Vevo770超聲儀（加拿大VisualSonics公司），采用30 MHz高頻探頭進行小鼠超聲檢查，將小鼠吸入麻醉，取胸骨旁左心室長軸觀，在二尖瓣鍵索乳頭肌水平取M型超聲切面圖像，獲得二維引導下10個心動周期的M型超聲心動圖記錄并測量左心室舒張期前壁厚度（LVAWd），左心室舒張期后壁厚度（LVPWd），左心室射血分數(shù)（LVEF）和短軸縮短率（FS）。

心肌肥厚指數(shù)測定：術(shù)后4周、8周，小鼠禁食12 h稱重，處死，摘取心臟，精密天平稱全心重量（HW），剪除心房和右心室，稱左心室重量（LVW），計算心重指數(shù)（HWI）=HW/BW，左心室重量指數(shù)（LVWI）=LVW/BW，肺臟重量與體重的比值（LW/ BW）以及心臟重量與脛骨長度比值（HW/TL）。左心室重量指數(shù)表示心肌肥厚程度。取部分左心室組織放入凍存管，標號后立即置于- 80℃冰箱。

心肌組織學分析：沿左心室冠狀面中部切取環(huán)狀心肌組織塊，4%甲醛固定過夜，酒精梯度脫水后石蠟包埋，進行HE染色以及Masson染色，光學顯微鏡下拍照（400倍），用Image-Pro Plus 5.0軟件隨機測定HE染色切片中五個視野心肌細胞橫截面積（CSA）后統(tǒng)計分析，計算心肌纖維化面積。

免疫蛋白印跡（Western blot） 法測定核轉(zhuǎn)錄因子-κB蛋白表達：取約 100 mg左心室心肌組織加入裂解液剪碎后移入1.5 ml離心管中，超聲粉碎，4℃12 000 rpm離心15 min，進行蛋白定量，取等量的樣品進行變性，SDS-聚丙烯酰胺凝膠，90 V恒壓電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜，加入1:800稀釋一抗，4℃過夜，用洗膜液漂洗后加入1:1000 稀釋的二抗，搖床上雜交90 min，用TBST（NaCL87.6 g，Tris-HCL緩沖液100 ml，加Tween20 5 ml，轉(zhuǎn)入1 L雙蒸水調(diào)整pH至7.4）沖洗3遍，每次5 min，然后加上化學發(fā)光劑（ECL）顯色，上機檢測以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，根據(jù)NF-κB和β-actin密度分析結(jié)果比值。

TNF-α、IL-1β、羥胖氨酸水平的測定：用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測血清TNF-α、IL-1β的濃度。藥物干預后斷頭取血4 ml，分離血清，-20℃保存。4℃3 000 r/min 離心5 min，取上清液，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行。用堿水解法測定心肌組織羥脯氨酸（Hyp）的含量。

2 結(jié)果

4組小鼠基本情況和TAC模型建立：假手術(shù)組小鼠生長發(fā)育良好，皮毛光滑、活動靈活、攝食攝水正常。TAC術(shù)后1周小鼠出現(xiàn)活動量降低，攝食減少。TAC+纈沙坦組、TAC+阿托伐他汀組小鼠的狀況較TAC組有好轉(zhuǎn)。假手術(shù)組無小鼠死亡，TAC組小鼠的存活率83.3%（10/12）。最終完成實驗的小鼠共42只，其中假手術(shù)組12只，TAC組、TAC+纈沙坦組、TAC+阿托伐他汀組各10只。4周后假手術(shù)組和TAC組隨機各處死2只取心臟觀察，與假手術(shù)組比較，TAC組心臟明顯增大，重量增加。超聲心動圖顯示：TAC組LVAWd、LVPWd明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01） ，表明心肌肥厚模型建立成功。

4組小鼠的超聲心動圖檢測結(jié)果比較（圖1、表1）：與假手術(shù)組相比，TAC組小鼠LVAWd、LVPWd在術(shù)后4周、8周均有增厚（P＜0.01），各組小鼠的LVEF、FS差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。提示心臟整體收縮功能正常，表明心肌肥厚模型建立而沒有發(fā)生心力衰竭。與TAC組比較，TAC+纈沙坦組、TAC+阿托伐他汀組LVAWd、LVPWd均顯著降低（P＜0.01）。

圖1 四組小鼠心臟M型超聲心動圖切面圖像

表1 四組小鼠超聲心動圖參數(shù)

表1 四組小鼠超聲心動圖參數(shù)

注：LVAWd：左心室舒張期前壁厚度，LVPWd：左心室舒張期后壁厚度，LVEF：左心室射血分數(shù)，F(xiàn)S：短軸縮短率。與假手術(shù)組比**P＜0.01；與TAC組比△△P＜0.01

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4組小鼠的心肌肥厚指數(shù)比較（圖2）：與假手術(shù)組比較，TAC組的心重指數(shù)（HWI）、左心室重量指數(shù)（LVWI）、LW/BW、HW/TL比值均升高（P＜0.01），說明TAC組心肌肥厚。TAC+阿托伐他汀組和TAC+纈沙坦組 HWI、LVWI、LW/BW、HW/TL與TAC組相比顯著降低（P＜ 0.01）。

圖2 四組小鼠的心重指數(shù)、左心室重量指數(shù)、肺臟重量/體重比值、心臟重量/脛骨長度比值的比較

心肌組織形態(tài)學的影響（圖3、4、5）：HE染色顯示，4周后假手術(shù)組心肌纖維細胞排列整齊、形態(tài)完整。TAC組心肌細胞肥大，心肌纖維排列紊亂，形態(tài)不規(guī)整，胞核深染。而TAC+纈沙坦組和TAC+阿托伐他汀組心肌細胞排列整齊，心肌細胞肥大減輕，細胞間隙縮小。TAC術(shù)后4周和8周的心肌細胞橫截面積顯著增加（P＜0.01），與TAC組相比，TAC+纈沙坦組和TAC+阿托伐他汀組的心肌細胞橫截面積顯著減?。≒＜0.01），但兩組間差異無統(tǒng)計學意義。提示阿托伐他汀和纈沙坦抑制了壓力負荷介導的心肌細胞橫截面積的增大。圖3為術(shù)后4周和8周的HE染色選自每組10只小鼠的切片中抽樣顯示的圖片。

Masson染色：膠原纖維呈藍綠色，心肌纖維呈紅色。假手術(shù)組膠原組織染色均為陰性，心肌纖維排列整齊；TAC組心肌細胞腫大，肌纖維排列疏松紊亂，間質(zhì)中有膠原纖維增生。TAC+阿托伐他汀組膠原纖維沉積改善效果最佳，且優(yōu)于TAC+纈沙坦組，兩種藥物均能有效抑制小鼠心肌肥厚和纖維化。圖4為術(shù)后4周和8周的Masson染色選自每組10只小鼠的切片中抽樣顯示的圖片。

圖3 蘇木素-伊紅染色觀察術(shù)后4周、8周四組小鼠心肌組織的變化（×400）

圖4 馬松染色觀察干預4周、8周后四組小鼠心肌組織的變化（×400）

Western blot 法測定小鼠心肌組織 NF-κB含量的測定（圖6）：與假手術(shù)組相比，TAC組NF-κB表達明顯升高（P＜0.01）；與TAC組相比，TAC+阿托伐他汀組、TAC+纈沙坦組NF-κB 表達明顯降低（P＜0.01），但TAC+阿托伐他汀組與TAC+纈沙坦組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

Hyp、TNF-α、IL-1β含量測定：與假手術(shù)組相比，TAC組、TAC+阿托伐他汀組、TAC+纈沙坦組Hyp明顯增加，TNF-α、IL-1β濃度也明顯升高（P＜0.01）；與TAC組相比，TAC+阿托伐他汀組和TAC+纈沙坦組Hyp明顯減少，纖維化程度減輕（P＜0.01），TNF-α、IL-1β濃度明顯降低（P＜0.01）。

圖5 四組小鼠在TAC術(shù)后4周、8周小鼠心肌細胞橫截面積、心肌纖維化面積的變化

圖6 免疫蛋白印跡法檢測4組小鼠心肌組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB的含量比較

表2 四組小鼠血清中羥脯氨酸、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β含量

表2 四組小鼠血清中羥脯氨酸、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β含量

白細胞介素-1β (μg/L)假手術(shù)組235±341.58±0.380.11±0.04 TAC組382±22*2.74±0.14**0.24±0.06**TAC+纈沙坦組 300±28**△△2.26±0.38**△△0.20±0.03**△△TAC+阿托伐他汀組276±18*△△1.94±0.49*△△0.15±0.04*△△分組羥脯氨酸(μg/g)腫瘤壞死因子-α (μg/L)

3 討論

心肌肥厚是眾多心血管疾病共同的病理過程，研究發(fā)現(xiàn)肥厚的心肌中存在嚴重的炎癥反應，而一系列的炎癥應答會加重心肌損害，引起心肌重構(gòu)，最終會導致心力衰竭[4]。心肌肥厚以心肌細胞肥大及間質(zhì)成分的改變（心肌重構(gòu)）為特點。本實驗旨在觀察經(jīng)阿托伐他汀干預后壓力超負荷所致心肌肥厚小鼠心肌組織中炎癥細胞因子的表達，探討阿托伐他汀對心肌重構(gòu)的影響及可能機制，為臨床治療提供理論及實踐依據(jù)。

各種病理性刺激引起的壓力負荷（如高血壓、主動脈狹窄）通過信號通路轉(zhuǎn)導，在早期引起心肌細胞代償性的肥大，表現(xiàn)為心室壁的增厚和心室收縮功能的增強[5]。胸主動脈弓縮窄術(shù)致心肌肥厚模型是通過增加心臟的壓力負荷從而產(chǎn)生明顯的左心

室肥厚，左心室舒張功能減退和心室重構(gòu)。本實驗參照文獻建立小鼠壓力負荷引起心肌肥厚模型[6]，TAC術(shù)后4周超聲觀察左心室室壁增厚，而左室射血分數(shù)正常。HWI、LVWI、LW/BW、HW/TL顯著性增加，結(jié)合HE染色見心肌細胞肥大，CSA顯著增大。Masson染色心肌纖維增粗，膠原纖維增生。Hyp水平明顯增加，纖維化明顯加重。提示TAC術(shù)后4周即已形成心肌肥厚和心肌纖維化，TAC模型成功建立。

他汀類藥物獨立于調(diào)脂作用以外的作用包括：改善血管內(nèi)皮功能失調(diào)、抑制炎癥反應、抗血栓形成、穩(wěn)定動脈硬化斑塊。研究結(jié)果表明阿托伐他汀組可以減輕壓力負荷增加引起的小鼠心肌肥厚程度，降低HWI、LVWI、LW/BW、HW/TL的比值。HE染色和Masson染色證明心肌細胞肥大程度減輕，膠原纖維減少。提示阿托伐他汀抑制CSA和纖維化面積的增大，能有效改善壓力超負荷所致小鼠心肌肥厚和纖維化，對心肌肥厚小鼠心室重構(gòu)有明顯的改善作用。

心肌肥厚時心肌局部有大量的炎癥介質(zhì)活化，如NF-κB、TNF-α、IL-1β 等[7]。炎癥因子主要通過激活炎癥信號通路下游NF-κB參與心肌肥厚反應[8]。核因子NF-κB是炎癥啟動、調(diào)節(jié)的關(guān)鍵核因子，NF-κB可刺激TNF-α和IL-1β等細胞因子的表達[9]。NF-κB激活后可促進心臟形成心肌肥厚，抑制 NF-κB 的過度激活可有效抑制心肌肥厚及氧化應激對心肌的損傷[10]。NF-κB炎癥信號通路激活，其受控的TNF-α、IL-1β也出現(xiàn)逐漸升高的表達趨勢。TNF-α可以誘導心肌肥厚。與TNF-α相似，IL-1β的表達也隨著心肌肥厚的發(fā)展而增加，其表達量與左心室的肥厚程度呈正相關(guān)[11]。TAC組的心肌中NF-κB的蛋白含量表達升高，血清 TNF-α和IL-1β含量升高，說明壓力后負荷導致的心肌肥厚使炎癥反應擴大，阿托伐他汀組、纈沙坦組NF-κB的蛋白含量表達降低，TNF-α、IL-1β水平下降，說明阿托伐他汀通過抑制NF-κB的活化而下調(diào)TNF-α、IL-1β炎癥細胞因子的表達，發(fā)揮抗炎和抑制心肌肥厚的作用，改善心室重構(gòu)和功能。2002年美國公布的氯沙坦高血壓終點減少干預（LIFE）研究在新型與傳統(tǒng)抗高血壓藥物的療效對比方面, 首次顯示血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑氯沙坦優(yōu)于β受體阻滯劑阿替洛爾[12]。結(jié)果進一步證實血管緊張素受體阻滯劑可逆轉(zhuǎn)左心室肥厚。

綜上，阿托伐他汀能通過抑制NF-κB的活化而下調(diào)TNF-α、IL-1β等炎性細胞因子的含量，降低心肌組織中的炎癥反應，抑制心室壁增厚、減少心肌細胞肥大和膠原產(chǎn)生，改善心腔擴大、心室肥厚，最終改善左心室重構(gòu)，抑制心肌肥厚的發(fā)展，這一作用可能是阿托伐他汀抑制心肌肥厚，改善心功能的機制之一，這為臨床防治心肌肥厚提供新的思路。作為陽性對照組的纈沙坦，在本實驗中再次重現(xiàn)了改善左心室重構(gòu)的藥理作用，說明了本實驗中模型的建立是成功的。

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Protective Roll of Atorvastatin on Cardiac Remodeling Induced by Pressure Overload in Experimental Mice With its Mechanism

ZHAO Di, WANG Wei, ZHANG Xiao-juan, GUO Wei-xing, ZHAO Tian, JIANG Hong-ju, ZHAO Zhuo.
First Clinical College, Shandong University of Chinese Medicine, Jinan (250014), Shandong, China

Objective: To observe the protective roll of atorvastatin on post-operative cardiac remodeling induced by transverse aortic constriction (TAC) in experimental mice with its possible mechanism.

Atorvastatin; Pressure overload; Transverse aortic constriction; Myocardial hypertrophy; infammatory factor

2015-03-12）

（編輯：許 菁）

國家自然基金面上項目（81270715）；山東省優(yōu)秀中青年科學家科研獎勵基金(BS2010YY005)

250355 山東省濟南市，山東中醫(yī)藥大學（趙地、趙添）；山東省胸科醫(yī)院 心血管中心（王維、張小娟）；山東省醫(yī)學科學院院長辦公室（郭偉星）；山東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 心內(nèi)科（姜紅菊）；山東大學附屬濟南中心醫(yī)院 心內(nèi)科（趙卓）

趙地 博士研究生 主要從事心血管疾病的臨床研究 Email: gangqinshi1988@163.com 通訊作者：趙卓 Email:zhaozhauo1230@163.com

R54

A

1000-3614（2015）11-1090-06

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.11.014