縫隙連接蛋白及其在牙髓組織中的表達和作用

閆勝男, 劉富萍, 李 賀, 王舒煜, 張 琦 綜述; 張志民 審校

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院, 吉林 長春 130000)

縫隙連接蛋白及其在牙髓組織中的表達和作用

閆勝男, 劉富萍, 李 賀, 王舒煜, 張 琦 綜述; 張志民 審校

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院, 吉林 長春 130000)

縫隙連接作為電突觸的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及相鄰細胞間的通訊通道，近年來倍受關(guān)注, 其主要組成蛋白——縫隙連接蛋白參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展，從而為預(yù)防和治療疾病提供了重要的依據(jù)。本文就縫隙連接蛋白及其在牙髓組織中的表達和作用作一綜述。

縫隙連接蛋白; 縫隙連接; 炎癥; 牙髓組織

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.12.013

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(12): 754]

縫隙連接蛋白(connexin,Cx)廣泛存在于哺乳動物的細胞內(nèi)，目前已發(fā)現(xiàn)的人類基因編碼的Cx有21種亞型，主要根據(jù)其分子量大小進行命名，如分子量為26、32、43 KD者，則命名為Cx26、Cx32、Cx43[1]。Cx除參與細胞自身的生長、分裂、分化及凋亡等過程外，其所介導(dǎo)的縫隙連接通道(gap junction channel,GJC)在調(diào)節(jié)細胞間的信息交流過程中也有重要作用。臨床上很多研究均發(fā)現(xiàn)，Cx可調(diào)節(jié)基因的表達及細胞遷移，與細胞生長、分化、創(chuàng)面愈合、瘢痕形成、心血管疾病、腫瘤及神經(jīng)系統(tǒng)等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。目前，關(guān)于Cx與牙生長、發(fā)育及齲損發(fā)生發(fā)展等的關(guān)系在國外已有初步研究，國內(nèi)尚未有這方面的報道。本文就Cx及其在牙髓組織中的表達和作用作一綜述。

1 縫隙連接(gap junction，GJ)概述

1.1 GJ的結(jié)構(gòu)

GJ是指相鄰細胞間的跨膜通道，其所構(gòu)成的細胞縫隙連接通訊(gap junction intercellular communication, GJIC)能夠調(diào)節(jié)各種生理過程。自Robertson[2]于1963年首先詳細描述了細胞間存在著一個呈六角形排列的格子(lattice)，即縫隙連接以后，許多學(xué)者都對其結(jié)構(gòu)和功能進行了大量研究，到上世紀80年代對GJ的認識已相當(dāng)深入。GJ由一對連接小體(hemichannel)組成，兩個連接小體分別貫穿于相鄰細胞相對的細胞膜中，每個連接小體均由6個連接蛋白(connexin)分子聚合而成(6個鏈接蛋白分子呈環(huán)行排列，并在中間形成小孔)。6個相同的連接蛋白可組成連接小體的同源聚合體，而6個不同的連接蛋白則可組成連接小體的異源聚合體。一對連接小體相互對合，即可利用各自的小孔共同構(gòu)成孔道結(jié)構(gòu)，即縫隙連接通道，可允許小分子物質(zhì)和離子自由進出[3]。Cx及其介導(dǎo)的縫隙連接結(jié)構(gòu)如圖1[4]所示。

連接蛋白分子結(jié)構(gòu)包括4個跨膜區(qū)域，4個細胞外環(huán)(EL1～2)和1個細胞內(nèi)環(huán)(CL)，兩端分別是胞內(nèi)側(cè)的氨基(NT)和羧基(CT)

圖1 Cx及其介導(dǎo)的縫隙鏈接結(jié)構(gòu)

1.2 GJ的功能

GJ可在細胞間傳遞離子、小分子等代謝物質(zhì)及次級信使，且具有傳導(dǎo)快、低阻抗、延擱時間短等特點。近期研究發(fā)現(xiàn)，GJ并不僅是細胞間物質(zhì)傳遞的通道，除參與細胞間活動的協(xié)調(diào)、信息傳遞以及神經(jīng)脈沖的傳導(dǎo)生成、蔓延和調(diào)控過程外，還可過濾電信號，與細胞的代謝和分化、物質(zhì)的運輸和電興奮的傳導(dǎo)等均有密切關(guān)系；其在胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織再生及腫瘤中均起著重要的作用[3，5]。目前已證實，采用化學(xué)方法抑制GJIC的功能后，可影響細胞周期；在小鼠脂肪細胞培養(yǎng)中使用GJ阻滯劑18-α甘草次酸、庚醇或生胃酮時，能抑制克隆過程中的細胞有絲分裂過程；在人類肺成纖維細胞培養(yǎng)中使用順鉑，則可誘導(dǎo)GJC在細胞的 G1/S 期時關(guān)閉，從而使p53表達增多并誘導(dǎo)細胞早衰[4]。

2 Cx的作用

2.1 Cx的結(jié)構(gòu)

Cx是一種跨膜蛋白，首先在細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成并在高爾基體聚合成半通道，然后再通過高爾基體轉(zhuǎn)運至細胞膜。目前在哺乳動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的Cx有20余種亞型，它們共享1個分子結(jié)構(gòu)，即4個跨膜區(qū)域、2個細胞外環(huán)和1個細胞內(nèi)環(huán)，兩端分別是胞內(nèi)側(cè)的氨基和羧基，通常在細胞膜的特定區(qū)域以六聚體形式形成GJC及連接蛋白半通道，并允許分子量小于1 KD 的小分子物質(zhì)如 Ca2+、NAD+、ATP等自由通過，從而形成縫隙連接的細胞間通訊功能(GJIC)[4-6]。

2.2 Cx的非通訊功能

臨床研究發(fā)現(xiàn)，Cx43表達可影響縫隙連接的形成和功能，如Cx43表達上調(diào)可增強縫隙連接的通訊功能[7]。目前已證實，Cx43在心肌缺血預(yù)處理中有心肌保護作用[1]。近年來，對Cx家族的研究范圍已經(jīng)擴展到心臟以外的其他器官。臨床研究表明，在腫瘤(如乳腺癌、前列腺癌、肺癌和其他癌癥)的組織中，可觀察到Cx的表達缺乏或異常，根據(jù)已有的相關(guān)研究成果猜測，Cx可通過傳輸信號分子及調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移和凋亡而抑制腫瘤的生長，并認為這種對癌癥的影響行為可能取決于Cx本身，而不是細胞間的耦合[8]。有學(xué)者將新生小鼠的純化施萬細胞與坐骨神經(jīng)膠質(zhì)生長因子2(GGF2，Nrg1的同種類型)共同培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，在初代培養(yǎng)中可見Cx32表達上調(diào)；若敲除小鼠施萬細胞中的Cx32基因，則僅對促進細胞有絲分裂的GGF2因子有較小的回應(yīng)，也未增加施萬細胞間的電耦合[5]。以上結(jié)果說明，Cx32的表達異常與否與細胞分裂有直接作用，并進一步證實Cx本身對癌癥有影響作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，阻止Cx43表達能降低小鼠P19癌細胞系神經(jīng)元的發(fā)育成熟速度，表明Cx43在神經(jīng)系統(tǒng)成熟中起核心作用[9]。目前已明確，Cx43除對大腦細胞的遷移有影響作用，還能加速傷口肉芽組織的形成和重塑，從而促進組織愈合[2]。

2.3 Cx在炎癥中的作用及可能的機制

炎癥是一系列復(fù)雜的病理過程，包括細胞因子、生長因子、趨化因子的釋放，以及中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等炎細胞由血液向組織間隙的遷移，這些過程均需要細胞間通訊功能的協(xié)調(diào)和參與，而縫隙連接所形成的跨膜通道則可為鄰近細胞提供直接的物質(zhì)信息交換途徑[10]。在缺氧環(huán)境、細胞因子和其他因素的作用下，有學(xué)者假設(shè)線粒體Cx43可激活白細胞并使活性氧ROS大量生成。大量ROS可以激活氧化還原反應(yīng)敏感的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和轉(zhuǎn)錄因子,使之參與炎癥反應(yīng)的始動。這些轉(zhuǎn)錄因子包括NF-KB、activator protein(AP)-l, 它們可通過對粘附分子和炎癥性細胞因子進行調(diào)控而引起基因表達編碼蛋白，以適應(yīng)機體的缺氧和炎癥反應(yīng)；而炎癥反應(yīng)又可激活內(nèi)皮細胞、白細胞、血小板，從而使這些活化的細胞通過表達粘附分子和促炎癥反應(yīng)因子引起內(nèi)皮細胞的損傷和功能障礙[11-12]。以上過程可能就是Cx43的表達在炎性疾病中的作用機理。

3 Cx與牙髓組織

3.1 牙髓組織

牙髓是來源于外胚間葉的疏松結(jié)締組織，位于牙本質(zhì)所形成的髓腔內(nèi)，具有形成牙本質(zhì)、營養(yǎng)、感覺、防御和修復(fù)等功能。牙髓組織中含有細胞、神經(jīng)、血管、淋巴管和其他細胞外基質(zhì)，可分為4層，即靠近牙本質(zhì)的成牙本質(zhì)細胞層、緊鄰成牙本質(zhì)細胞層的乏細胞層(又稱Weil層)、無細胞內(nèi)側(cè)的多細胞層和牙髓中央?yún)^(qū)的固有牙髓(也稱髓核)。牙髓中的細胞主要有成牙本質(zhì)細胞、成纖維細胞、組織細胞、未分化間充質(zhì)細胞及樹突狀細胞等[13]。其中，成纖維細胞是牙髓中的主要細胞，故又稱牙髓細胞，具有合成膠原蛋白、膠原蛋白酶、蛋白聚糖及糖胺聚糖等功能。當(dāng)前期牙本質(zhì)受到刺激時，牙髓多細胞區(qū)的成纖維細胞(dental pulp fibroblasts，DPFs)可分化為成牙本質(zhì)細胞并形成修復(fù)性牙本質(zhì)[14]；若刺激進一步加重，則可使牙髓組織充血，甚至發(fā)展為牙髓炎；當(dāng)牙髓由于感染等發(fā)生炎癥時，則難以完全的修復(fù)性再生，這對臨床牙髓病的治療具有參考價值[13]。

3.2 Cx在牙髓組織中的表達及定位

Koling等[15]采用冷凍斷裂實驗及電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，GJ存在于成牙本質(zhì)細胞間及成牙本質(zhì)細胞與鄰近成牙本質(zhì)細胞層的細胞間。大量GJ可通過提供細胞間信號分子通道，以維持統(tǒng)一的細胞活動，并使之形成均勻一致的前期牙本質(zhì)層，在牙齒發(fā)育過程中起重要作用[13]。Beyer等[16](1989)研究發(fā)現(xiàn)，Cx43在成纖維細胞中有表達。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞中除表達Cx43外，還有其他Cx的表達。Fried等[17]采用免疫組化的方法研究時發(fā)現(xiàn)，老鼠牙髓組織在發(fā)育過程中及受傷時均有Cx26、Cx32、Cx43的表達；在早期分化階段，即成釉細胞合成和分泌釉基質(zhì)蛋白時有Cx32和Cx43的表達，其中Cx32主要在上皮細胞中表達，而Cx43則廣泛分布于上皮細胞和間充質(zhì)細胞中，并同時還表達于分化期和功能型(即能分泌牙本質(zhì)基質(zhì))的成牙本質(zhì)細胞中。而在成年老鼠的牙中，僅觀察到Cx26和 Cx43在成牙本質(zhì)細胞層呈或低或高水平的表達，并未發(fā)現(xiàn)有Cx32的表達。

3.3 Cxs在牙髓組織中的作用

Cxs是以分子量為基礎(chǔ)命名的跨膜蛋白家族，在不同的組織中均有表達，最初以形成細胞間通道——縫隙連接而聞名。GJ所介導(dǎo)的細胞間通訊功能在維持和調(diào)節(jié)正常牙體組織生長過程中有重要作用[17]。Fried等[18]報道，在老鼠牙髓的發(fā)育期、發(fā)育完成期及病理狀態(tài)下均有Cx的表達，說明Cx可能與牙髓組織的生長、發(fā)育及病理生理等過程有關(guān)。Ibuki N等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在牙髓組織中有Cx32和Cx43的雙重表達，特別是在多細胞區(qū)的DPFs中Cx32表達更強烈；從而可推測：牙髓多細胞區(qū)的DPFs可產(chǎn)生一些蛋白質(zhì)并能誘導(dǎo)牙髓多細胞區(qū)的細胞分化為成牙本質(zhì)細胞,而Cx32在多細胞區(qū)的高表達則說明其可保護牙髓組織免受來自牙本質(zhì)小管的各種刺激,以防齲損的發(fā)生。Centeno等[17]通過控制幼鼠飲用水中的氟濃度以模擬氟斑牙的形成，經(jīng)半定量RT-PCR技術(shù)和堿性磷酸酶活性測定發(fā)現(xiàn)，氟能改變小鼠切牙牙髓組織中不同類型Cxs的表達水平及堿性磷酸酶(ALP)活性；提示，相關(guān)Cxs的表達可能參與調(diào)整離子和小分子物質(zhì)在細胞間傳遞的滲透率，并通過控制和維持體內(nèi)蛋白質(zhì)的基因表達平衡來適應(yīng)體內(nèi)氟含量的增高，從而影響牙的礦化。

3.4 Cx43

目前，研究Cx43相關(guān)的報道較多。Imad About等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在牙發(fā)育中，Cx43主要定位于上皮細胞和間葉細胞，并與細胞的分化程度相關(guān)。Cx43在正常恒牙的成牙本質(zhì)細胞及其分化過程中均有表達，而在齲損的成牙本質(zhì)細胞中的表達量則明顯上調(diào)，說明其可能與修復(fù)性牙本質(zhì)的形成有關(guān)?，F(xiàn)已證實，Cx43介導(dǎo)的縫隙連接在硬組織形成過程中起重要作用，它們在組織發(fā)育過程中可允許小于1.2 KD的小分子包括細胞內(nèi)Ca2+自由通過。有研究發(fā)現(xiàn)，Cx43的表達上調(diào)先于牙的發(fā)育及骨的形成，若在小鼠胚胎時期禁止Cx43的表達，則可導(dǎo)致所有類型骨的發(fā)育和礦化且出現(xiàn)嚴重缺陷，并可使牙的發(fā)育和萌出延遲；提示，Cx43在骨髓、牙髓干細胞的分化及礦化過程中起著重要的作用[20]。

Murakami等[21](2001)研究發(fā)現(xiàn)，Cx43在小鼠切牙的成牙本質(zhì)細胞和牙髓細胞中均有表達，表明Cx43在年輕成牙本質(zhì)細胞中高度表達。Murakami[22]采用免疫電鏡檢測成牙本質(zhì)細胞中的Cx43時發(fā)現(xiàn)，在細胞胞體間及細胞代謝過程中均存在由Cx43介導(dǎo)的縫隙連接；同時還發(fā)現(xiàn)，這種結(jié)構(gòu)只存在于成牙本質(zhì)細胞的代謝過程中，而在施萬細胞或神經(jīng)纖維中則未發(fā)現(xiàn)此結(jié)構(gòu)。近年來有學(xué)者還發(fā)現(xiàn)[23]，Cx43在細胞循環(huán)中可能是一種負調(diào)節(jié)蛋白，可通過其負調(diào)節(jié)作用而抑制細胞的過度繁殖。另有研究發(fā)現(xiàn)，老鼠牙髓組織細胞間所存在的由Cx43介導(dǎo)的GJ與堿性磷酸酶活性有關(guān)，當(dāng)牙本質(zhì)敏感及疼痛時，成牙本質(zhì)細胞中有Cx43的表達并伴隨有信號傳導(dǎo)及ATP釋放；說明Cx43在牙髓激惹狀態(tài)中有重要作用，并可作為牙髓細胞生長、分化及磷酸酶活性等的標(biāo)志[24-25]。

4 小結(jié)

GJ是細胞間物質(zhì)交換特有的跨膜通路，Cx作為組成此通路的主要蛋白近年來備受關(guān)注，并在不同組織和器官中均發(fā)現(xiàn)有不同類型的Cx的存在；而且其表達異常與生長、發(fā)育及多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。關(guān)于Cx與疾病的關(guān)系，在心肌缺血及腫瘤方面的研究較多，并發(fā)現(xiàn)Cx在參與疾病發(fā)生發(fā)展的過程中有不同的機制。迄今為止，已有國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)牙髓組織中也含有Cx43、Cx32和Cx26，并發(fā)現(xiàn)這些Cx與牙髓組織的發(fā)育、分化及病理生理過程關(guān)系密切。但關(guān)于Cx是否參與牙髓炎癥的發(fā)生、發(fā)展及其具體作用機制，目前尚未有學(xué)者研究報道，如果能明確Cx的作用機制，將會在攻克牙髓炎方面邁進一大步。

[1]Catheleyne D, Raf P, Humbert DS,etal. Pannexins, distant relatives of the connexin family with specific cellular functions [J].BioEssays, 2009，31(9):953-974.

[2]Robertson JD.The occurrence of a subunit pattern in the unit membranes of club endings in Mavthner cell synapses in goldfish brains[J].CellBiol,1963,10:201-221.

[3]Shimizu K,Stopfer M.Gap junctions[J].CurrentBiol, 2013,23(23):1026-1031.

[4]Vinken M, Decrock E,De Vuyst E,etal.Connexins: sensors and regulators of cell cycling[J].BiochimBiophysActa, 2011,1815(1):13-25.

[5]Zhou JZ,Jiang JX.Gap junction and hemichannel- independent actions of connexins on cell and tissue functions - an update[J].FEBSLett, 2014,588(8):1186-1192.

[6]Tarzemany R, Jiang G, Larjava H,etal.Expression and function of connexin 43 in human gingival wound healing and fibroblasts[J].PLoSOne, 2015,10(1):e0115524.

[7]Wang CY,Liu HJ,Chen HJ,etal.AGE-BSA down-regulates endothelial connexin43 gap junctions[J].BMCCellBiol, 2011,16:12-19.

[8]Cronier L, Crespin S, Strale PO,etal.Gap junctions and cancer: new functions for an old story [J].AntioxidRedoxSignal, 2009,11(2):323-328.

[9]Ellis KM,O′Carroll DC,Lewis MD，etal.Neurogenic potential of dental pulp stem cells isolated from murine incisors[J].StemCellResTher, 2014,5(1):30.

[10]Scheckenbach KE,Crespun S,Kwak BR,etal.Connexin channel dependent signaling pathways in inflannation[J].JVascRes, 2011,48(2):91-103.

[11]Wang R, Huang F, Chen Z,etal.Downregulation of connexin 32 attenuates hypoxia/reoxygenation injury in liver cells[J].JBiochemMolToxicol, 2015,29(4):189-197.

[12]Le HT, Sin WC, Lozinsky S,etal.Gap junction intercellular communication mediated by connexin43 in astrocytes is essential for their resistance to oxidative stress[J].JBiolChem, 2014, 289(3): 1345-1354.

[13]于世鳳. 口腔組織病理學(xué) [M]. 6版 . 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2011:64-66.

[14]Ibuki N, Yamaoka Y, Sawa Y,etal. Different expressions of connexin 43 and 32 in the fibroblasts of human dental pulp[J].TissueCell, 2002,34(3):170-176.

[15]Koling A, Rask-Andersen H, Gagger-Sjoback D. Membrane junctions on odontoblasts: A freeze-fracture study[J].ActaOdontolScand,1981,39:355-360.

[16]Beyer EC, Kistler J, Paul DL,etal. Antisera directed against connexin43 peptides react with a 43-kDa protein localized to gap junctions in myocardium and other tissues[J].CellBiol,1989,108:595-605.

[17]Centeno VA, Fontanetti PA, Interlandi V,etal.Fluoride alters connexin expression in rat incisor pulp[J].ArchOralBiol, 2015,60(2):313-319.

[18]Fried K,Mitsiadis TA,Guerrier A,etal. Combinatorial expression patterns of the connexins 26, 32, and 43 during development, homeostasis, and regeneration of rat teeth[J].IntJDevBiol,1996,40(5):985-995.

[19]Imad A, Jean-Pierre P, Sylva R,etal.In vivo and in vitro expression of connexin43 in human teeth[J].ConnectiveTissueResearch,2002, 43: 232-237.

[20]Syed-Picard FN, Jayaraman T, Lam RS,etal.Osteoinductivity of calcium phosphate mediated by connexin 43[J].Biomaterials, 2013,34(15):3763-3774.

[21]Murakami S, Muramatsu T, Shimono M.Expression and localization of connexin 43 in rat incisor odontoblasts[J].AnatEmbryol(Berl), 2001,203(5):367-374.

[22]Muramatsu T, Hashimoto S, Shibukawa Y,etal. Immunoelectron microscopic observation of connexin43 in rat odontoblasts[J].MicroscResTech, 2013,76(10):988-991.

[23]Liu X, Yu L, Wang Q,etal.Expression of ecto-ATPase NTPDase2 in human dental pulp[J].JDentRes, 2012,91(3):261-267.

[24]Muramatsu T, Hamano H, Ogami K,etal. Reduction of connexin 43 expression in aged human dental pulp[J].IntEndodJ, 2004,37(12):814-818.

[25]Chung CK, Muramatsu T, Uekusa T,etal. Inhibition of connexin 43 expression and function in cultured rat dental pulp cells by antisense oligonucleotide[J].CellTissueRes, 2007,329(2):295-300.

Connexin proteins and research progress on connexins of dental pulp

YAN Sheng- nan, LIU Fu- ping, LI He, WANG Shu- yu, ZHANG Qi, ZHANG Zhi- min

(SchoolandHospitalofStomatology,JilinUniversity,Changchun130000,China)

Gap junction has attracted more and more attention in recent years because it plays the basic roles in electrical synapse structure and intercellular channel of communication. Connexins, the main composite proteins of gap junction, have been reported to be involved in the development of many diseases. This article reviews the research progress on connexins and the relationship between connexins and dental pulp.

connexin; gap junction; inflammation; dental pulp

2015-03-31

國家自然基金項目(81170945)

閆勝男(1989-)，女，漢族，河南商丘人。碩士生(導(dǎo)師：張志民)

張志民，E-mail：zhangzm1964@sina.com

R780.2

A

1005-2593(2015)12-0754-04