腐敗醋中微生物的分離鑒定及乳酸鏈球菌素對(duì)其抑制作用

李偉麗，趙 超，車建途，李東樂(lè)，易武華，趙麗娟

（1.北京威力格生物科技有限公司，北京 102200；2.山西水塔醋業(yè)股份有限公司，山西 清徐 030400）

腐敗醋中微生物的分離鑒定及乳酸鏈球菌素對(duì)其抑制作用

李偉麗1,2，趙 超1,2，車建途1,2，李東樂(lè)1,2，易武華2，趙麗娟2

（1.北京威力格生物科技有限公司，北京 102200；2.山西水塔醋業(yè)股份有限公司，山西 清徐 030400）

從腐敗醋中分離出84 株不同微生物菌株，通過(guò)對(duì)其形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色、16S rDNA測(cè)序，并與GenBank中已知序列進(jìn)行比對(duì)，以及進(jìn)一步測(cè)定16S～23S ITS，發(fā)現(xiàn)其由20 株解淀粉芽孢桿菌、12 株地衣芽孢桿菌、6 株芽孢桿菌屬1NLA3E、12 株蠟樣芽孢桿菌、4 株巨大芽孢桿菌、3 株短短芽孢桿菌、2 株短小芽孢桿菌、11 株凝結(jié)芽孢桿菌、12 株類芽孢桿菌、1 株耐酸乳酸菌、1 株產(chǎn)氣莢膜梭菌組成。除耐酸乳酸菌外，均為革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌。通過(guò)管碟法和比濁法測(cè)定了乳酸鏈球菌素（Nisin）對(duì)以上菌株的抑菌效價(jià)，顯示Nisin對(duì)腐敗醋中分離得到的微生物菌株均具有明顯的抑菌或殺菌活性。

腐敗醋；16S rDNA；16S～23S ITS；分離鑒定；乳酸鏈球菌素

在食用醋的生產(chǎn)、陳釀、貯存過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)食醋風(fēng)味變差甚至腐敗產(chǎn)生臭味的現(xiàn)象。在食用醋生產(chǎn)企業(yè)，夏季這種情況的產(chǎn)生尤為突出，其原因可能與夏季溫度較高，適宜微生物生長(zhǎng)繁殖有關(guān)[1-4]。盡 管在食醋的生產(chǎn)過(guò)程中添加了對(duì)大部分細(xì)菌和真菌有較強(qiáng)抑制作用的苯甲酸鈉等作為化學(xué)防腐劑，但本研究通過(guò)對(duì)腐敗醋離心收集菌體、多次洗滌去除雜質(zhì)沉淀，鏡檢等操作后發(fā)現(xiàn)腐敗醋中依然存在大量可能導(dǎo)致食醋腐敗的桿狀細(xì)菌。

乳酸鏈球菌素（Nisin），又稱乳酸鏈球菌肽或乳鏈菌肽，是由乳酸鏈球菌經(jīng)特定發(fā)酵所產(chǎn)生的多肽類抗菌物質(zhì)，能有效地抑制容易引起食品腐敗變質(zhì)的大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）[5-12]。Nisin的抑菌作用取決于其由34 個(gè)氨基酸組成小肽所具有的兩親性和所攜帶的正電荷，它們作用在細(xì)菌細(xì)胞壁所帶負(fù)電荷的陰離子成分上，形成孔狀結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞膜滲漏，導(dǎo)致小分子質(zhì)量的細(xì)胞成分如鉀離子、氫離子、氨基酸、核苷酸等物質(zhì)從胞內(nèi)流出，引起細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)在金黃色葡萄球菌菌液中加入Nisin，會(huì)導(dǎo)致菌體變形，質(zhì)壁分離，進(jìn)而菌體細(xì)胞破裂為殘片[10]。Nisin是一種純天然食品防腐劑。目前，我國(guó)已批準(zhǔn)Nisin作為一種純天然食品防腐劑廣泛用于乳制品、發(fā)酵飲品、罐藏食品、肉類及肉制品的防腐保鮮[5-12]。Nisin有望在食醋生產(chǎn)中Nisin取代廣泛應(yīng)用的化學(xué)防腐劑，從而減少化學(xué)防腐劑對(duì)人體的損害。

為考察導(dǎo)致腐敗醋產(chǎn)生的微生物種類及Nisin對(duì)這些微生物的抑制作用，本研究按照國(guó)標(biāo)中規(guī)定的分離細(xì)菌的方法，從腐敗醋中分離、培養(yǎng)微生物菌株，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，革蘭氏染色等實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而測(cè)定其16S rDNA和16S～23S ITS序列，從分子水平上對(duì)這些菌株進(jìn)行分類學(xué)鑒定。同時(shí)測(cè)定了Nisin對(duì)分離得到的腐敗醋污染菌株的抑菌活性，旨在為利用有效無(wú)毒的抑菌劑防治食醋腐敗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

腐敗醋由山西水塔醋業(yè)股份有限公司提供。

PCA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、效價(jià)檢測(cè)培養(yǎng)基 北京博奧星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 Marker 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；溶菌酶溶液、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；乳酸鏈球菌素 浙江新銀象公司；其他試劑均購(gòu)自北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱、搖床、分光光度計(jì)、熒光顯微鏡 重慶奧特光學(xué)公司；GeneAmp PCR System 2720（ABI）、厭氧培養(yǎng)袋、厭氧產(chǎn)氣袋、氧氣指示劑 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；ChampGel凝膠成像分析系統(tǒng) 北京賽智公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基和試劑配制

效價(jià)檢測(cè)培養(yǎng)基：蛋白胨8 g、酵母浸粉3 g、葡萄糖5 g、Na2HPO4·12H2O 2 g、氯化鈉5 g、吐溫-20 5 mL，調(diào)節(jié)pH 6.8，瓊脂粉15 g，115 ℃滅菌15 min備用。

用0.02 mol/L無(wú)菌稀鹽酸配制Nisin濃度為103U/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，室溫放置1 h，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫ú怀^(guò)7 d），需要時(shí)用0.02 mol/L無(wú)菌鹽酸溶液配制1 000、100、50、25、10、0 U/mL 6 種效價(jià)的溶液，分別標(biāo)記為5、4、3、2、1、0。

1.3.2 腐敗醋中微生物的鏡檢

取腐敗醋60 mL到100 mL無(wú)菌離心管中，8 000 r/min離心5 min，棄去上清收集沉淀；然后用60 mL無(wú)菌生理鹽水重新懸浮沉淀，8 000 r/min離心5 min，棄去上清收集沉淀；重復(fù)用無(wú)菌生理鹽水洗滌沉淀4～5 次，最后沉淀用2 mL無(wú)菌生理鹽水懸浮。取20 μL菌液，按照GB/T 4789.28—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 染色法、培養(yǎng)基和試劑》的方法用結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色和鏡檢。

1.3.3 腐敗醋中微生物的分離和鑒定

分離方法：以下操作在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。依據(jù)GB/T 4789.22—2003用25%滅菌碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)腐敗醋pH值至中性（pH 7.0），分別取100 μL，涂PCA平板、MC平板、MRS平板，各涂10 個(gè)平板。PCA平板和MC平板倒置平放于37 ℃生化培養(yǎng)箱，過(guò)夜培養(yǎng)，觀察菌落情況。MRS平板于37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h，觀察菌落情況。

挑取、轉(zhuǎn)接單菌落：PCA平板上的單菌落轉(zhuǎn)接到NB液體培養(yǎng)基，MC平板上的單菌落轉(zhuǎn)接到MC液體培養(yǎng)基后過(guò)夜培養(yǎng)（37 ℃，200 r/min，16～18 h），按照GB/T 4789.28—2003對(duì)菌液進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢。MRS平板上的單菌落轉(zhuǎn)接到MRS液體培養(yǎng)基，放置到圓底立式培養(yǎng)袋，袋中加入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋、氧氣指示劑，37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h。按照GB/T 4789.28—2003對(duì)菌液進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢。

1.3.4 腐敗醋中菌株基因組DNA的提取

取菌液2 mL，12 000 r/min離心2 min，棄上清收集菌體，按試劑盒的方法提取基因組DNA。提取后的基因組DNA作為擴(kuò)增16S rDNA和16S～23S ITS的模板。

1.3.5 16S rDNA序列擴(kuò)增

利用通用引物27F和1492R以菌株總DNA為模版進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。在50 μL PCR反應(yīng)體系中加入38 μL水、5 μL Buffer、4 μL dNTP、引物27F和1492R各l μL、0.5 μL模版、0.5 μL Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增程序：95 ℃變性5 min后，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后作為序列測(cè)定的模板，送北京市理化分析測(cè)試中心進(jìn)行測(cè)序。

1.3.6 16S～23S ITS序列擴(kuò)增

利用通用引物L(fēng)16S1349F和L523SR，以菌株總DNA為模版進(jìn)行PCR[13-14]。在50 μL PCR反應(yīng)體系中加入38 μL水、5 μL Buffer、4 μL dNTP、正向引物L(fēng)16S1349F和反向引物L(fēng)523SR各1 μL、0.5 μL 模版、0.5 μL Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增程序：95 ℃變性5 min后，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后作為序列測(cè)定的模板，送北京市理化分析測(cè)試中心進(jìn)行測(cè)序。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

將測(cè)序結(jié)果輸入數(shù)據(jù)庫(kù)http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/，使用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，找出與數(shù)據(jù)庫(kù)同源性最高的已知菌種，推測(cè)待定菌株可能的屬或種。

1.3.8 管碟法檢測(cè)Nisin抑菌活性

Nisin對(duì)從PCA平板和MC平板分離得到的好氧和兼性厭氧微生物菌株進(jìn)行抑菌活性測(cè)定：將效價(jià)檢測(cè)固體培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，加入適量菌懸液使培養(yǎng)基中菌液濃度達(dá)到5×105～5×106CFU/mL，混勻后倒入平板；平板放置水平臺(tái)面冷卻后，在平皿中均勻放入牛津杯（直徑8.00 mm），靜置10 min使其自然下沉；取200 μL已制備好的Nisin溶液加入牛津杯中，平穩(wěn)移至恒溫箱，37 ℃培養(yǎng)16 h左右，移去牛津杯觀察抑菌圈大小，利用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑d（mm），抑菌效果（X）計(jì)算公式為：

1.3.9 濁度法檢測(cè)Nisin抑菌活性

Nisin對(duì)經(jīng)MRS平板分離得到的兼性厭氧菌和厭氧菌的抑菌活性測(cè)定：將2.25 mL Nisin標(biāo)準(zhǔn)品溶液與1 mL菌懸液（OD600nm為1.0左右的指示菌溶液）加入含有15 mL MRS液體培養(yǎng)基的厭氧管中混勻；同時(shí)取2 個(gè)厭氧管分別加2.25 mL無(wú)菌稀鹽酸、1 mL指示菌混合液，再分別加入15 mL MRS液體培養(yǎng)基混勻，其中1 管作為同步培養(yǎng)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照，另1 管用于測(cè)定初始培養(yǎng)時(shí)的OD600nm；用MRS液體培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)零，37 ℃培養(yǎng)24～120 h、取樣，讀取OD600nm值并作相應(yīng)記錄。根據(jù)所得到的OD600nm值進(jìn)行抑菌率（I）分析，計(jì)算公式如下：

式中：OD1、OD2、OD0分別代表陽(yáng)性對(duì)照、待測(cè)樣品和初始培養(yǎng)的OD600nm值。抑菌活性實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果為。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗醋中微生物鏡檢

鏡檢發(fā)現(xiàn)，腐敗醋中含有包括長(zhǎng)桿菌和短桿菌等形態(tài)結(jié)構(gòu)有明顯差異的多種桿狀細(xì)菌（圖1）。

圖1 腐敗醋中的微生物Fig.1 Microorganisms observed in spoiled vinegar

2.2 腐敗醋中分離獲得菌株的形態(tài)觀察和革蘭氏染色

對(duì)分離得到的菌株編號(hào)，進(jìn)行菌落形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色和鏡檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離得到的菌株均呈桿狀形態(tài)的G+。

2.3 16S rDNA和16S～23S ITS測(cè)序

由表1、2可知，從腐敗醋中分離獲得84 株菌，其組成為20 株解淀粉芽孢桿菌、12 株地衣芽孢桿菌、6 株芽孢桿菌屬1NLA3E、12 株蠟樣芽孢桿菌、4 株巨大芽孢桿菌、3 株短短芽孢桿菌、2 株短小芽孢桿菌、11 株凝結(jié)芽孢桿菌、12 株類芽孢桿菌、1 株耐酸乳酸菌、1 株產(chǎn)氣莢膜梭菌。分離得到的菌株除一株耐酸乳酸菌外其余均為芽孢桿菌，均屬于G+。

表1 PCA培養(yǎng)基平板分離獲得的菌株Table 1 Bacterial strains separated from spoiled vinegar in PCA medium

表2 乳酸菌培養(yǎng)基平板分離獲得的菌株Table 2 Bacterial strains separated from spoiled vinegar in MCTable 2 Bact medium and MRS medium

2.4 指示菌的選取

根據(jù)測(cè)序比對(duì)結(jié)果，從PCA平板和MC平板分離獲得的菌株中選取112、204、105、2py01、104、301、212c、4py01、mc401分別作為解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、芽孢桿菌屬1NLA3E、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短短芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、類芽孢桿菌的指示菌。同樣在MRS平板分離得到的厭氧菌株中選取 mrs101、mrs102、mrs301、mrs305分別作為蠟樣芽孢桿菌、耐酸乳酸菌、凝結(jié)芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的指示菌。

2.5 管碟法檢測(cè)Nisin對(duì)指示菌的抑菌活性

由表3可知，Nisin對(duì)不同指示菌株均具有抑菌活性，其抑菌作用數(shù)值越大表示其抑菌效價(jià)越高。Nisin濃度為0時(shí)，有抑菌圈產(chǎn)生，說(shuō)明稀鹽酸對(duì)菌株105、2py01、104也有抑制作用，添加Nisin后，抑菌作用增強(qiáng)。

表3 管碟法測(cè)定Nisin對(duì)指示菌的抑菌作用Table 3 Bactericidal effect of Nisin on indicator strains using Oxford plate assssaayy

2.6 濁度法檢測(cè)Nisin對(duì)指示菌的抑菌活性

根據(jù)測(cè)序比對(duì)結(jié)果從MRS平板分離獲得的厭氧菌株或兼性厭氧菌株中選取mrs101、mrs102、mrs103、mrs305作為蠟樣芽孢桿菌、耐酸乳酸菌、凝結(jié)芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的指示菌。通過(guò)濁度法檢測(cè)Nisin對(duì)其抑菌效價(jià)。

表4 濁度法測(cè)定乳酸鏈球菌素對(duì)指示菌的抑菌作用Table 4 Bactericidal effect of Nisin on indicator strains usingTable 4 Bacte turbidity method

由表4和公式（2）計(jì)算可知，菌液中添加Nisin后，其對(duì)MRS培養(yǎng)基分離得到的mrs101、mrs102、mrs301、mrs305這4株菌的抑菌率分別為105.0%、105.0%、104.5%、108.5%，表明Nisin對(duì)它們均有很強(qiáng)的殺菌效果。由于Nisin的殺菌作用導(dǎo)致指示菌死亡溶解，從而造成添加Nisin后培養(yǎng)一定時(shí)間的菌液OD600nm值小于初始培養(yǎng)菌液OD600nm值，故抑菌率大于100%。

3 討 論

本研究從腐敗醋中分離得到的菌株除一株耐酸乳酸菌外均為芽孢桿菌。其中解淀粉芽孢桿菌菌株最多，其16S rDNA序列與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、萎縮芽胞桿菌的相同序列同源性均為99%，為了進(jìn)一步具體確定它們的歸屬，使用了正向引物L(fēng)16S1349F和反向引物L(fēng)523SR擴(kuò)增其16S～23S ITS[14-19]。

解淀粉芽孢桿菌基因組（G e n B a n k 登錄號(hào)NC_009725.1）中的16S～23S ITS序列存在10 條等位基因片段，利用正向引物L(fēng)16S1349F和反向引物L(fēng)523SR可以擴(kuò)增出2 條628 bp基因片段（僅有一個(gè)堿基不同），2 條512 bp基因片段（2 個(gè)堿基不同），6 條454 bp基因片段（5 條堿基序列一致，1 條有3 個(gè)堿基不同 ）?？莶菅挎邨U菌基因組（GenBank 登錄號(hào)NC_000964.3）中的16S～23S ITS序列存在10 條等位基因片段，利用正向引物L(fēng)16S1349F和反向引物L(fēng)523SR可以擴(kuò)增出2 條序列完全一致的626 bp基因片段，8 條序列不完全一致的446 bp基因片段。萎縮芽孢桿菌基因組（GenBank登錄號(hào)NC_014639.1）中的16S～23S ITS序列存在7 條等位基因片段，利用正向引物L(fēng)16S1349F和反向引物L(fēng)523SR可以擴(kuò)增出2條序列完全一致的632 bp的基因片段，5 條459 bp基因片段（4 條片段序列完全一致，另1 條多1 個(gè)堿基）。本實(shí)驗(yàn)中利用正向引物L(fēng)16S1349F和反向引物L(fēng)523SR擴(kuò)增出了3條基因片段，長(zhǎng)度分別為628、512、454 bp，取長(zhǎng)度為628 bp的片段測(cè)序后發(fā)現(xiàn)其序列與解淀粉芽孢桿菌的基因匹配。

王俊等[2]向固態(tài)發(fā)酵食用醋的無(wú)菌成品中直接添加分離得到的芽孢桿菌屬雜菌和葡糖桿菌屬雜菌，均引起了食用醋返混并產(chǎn)生酸臭味，均破壞了固態(tài)發(fā)酵食用醋成品的風(fēng)味。本實(shí)驗(yàn)則從腐敗醋中分離得到了一株產(chǎn)氣莢膜梭菌，該菌適宜的生長(zhǎng)溫度為37～47 ℃，在此溫度范圍內(nèi)其生長(zhǎng)和繁殖速率極快，世代間隔時(shí)間僅為8 min，此外其能夠利用多種糖，代謝過(guò)程會(huì)產(chǎn)生H2S。推測(cè)此產(chǎn)氣莢膜梭菌污染食醋后可能會(huì)導(dǎo)致食醋風(fēng)味發(fā)生變化，使其腐敗變臭。

Nisin對(duì)G+的抑菌效果明顯優(yōu)于對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌（G－）。G+和G－在結(jié)構(gòu)上的差異主要表現(xiàn)在細(xì)胞壁上。G+細(xì)胞壁肽聚糖含量豐富，交聯(lián)度高；而G－的細(xì)胞壁肽聚糖含量少，但組成復(fù)雜，主要包括磷脂、蛋白質(zhì)和脂多糖等，十分致密，僅允許分子質(zhì)量小于600 D的分子通過(guò)。Nisin的分子質(zhì)量約為3 500 D，無(wú)法正常通過(guò)G－細(xì)胞壁到達(dá)細(xì)胞膜。而Nisin對(duì)G+抑菌效果優(yōu)于對(duì)G－這一現(xiàn)象，從另一個(gè)側(cè)面證明了對(duì)細(xì)胞膜的吸附是Nisin發(fā)揮作用的必要條件[10]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分離獲得的細(xì)菌均為G+，提示食醋的細(xì)菌污染主要來(lái)源于G+。抑菌實(shí)驗(yàn)表明Nisin對(duì)從腐敗醋中分離得到的腐敗菌株均有明顯的抑菌或殺菌作用，與報(bào)道Nisin對(duì)G+具有抑菌或/和殺菌作用及機(jī)理的結(jié)果一致[5-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，管碟法檢測(cè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀，培養(yǎng)過(guò)程中不需要添加厭氧袋，適用于好氧菌及兼性厭氧菌的培養(yǎng)，但對(duì)厭氧菌或兼性厭氧菌不適用。濁度法檢測(cè)過(guò)程中使用了厭氧管培養(yǎng)厭氧菌或兼性厭氧菌，方法對(duì)好氧菌或兼性好氧菌不適用。

楊榮杰[4]研究了苯甲酸鈉對(duì)芽孢桿菌的最小抑菌濃度，結(jié)果表明苯甲酸鈉的最低抑菌濃度已經(jīng)超出了其在食品中允許的最大添加量。由此可見(jiàn)，在食品安全允許范圍內(nèi)，苯甲酸鈉對(duì)芽孢桿菌的抑制作用有限。該報(bào)道同時(shí)也研究了Nisin對(duì)芽孢桿菌的最小抑菌濃度，發(fā)現(xiàn)其對(duì)芽孢桿菌的最小抑菌濃度遠(yuǎn)小于其允許的最大添加量。本研究中，Nisin的抑菌濃度亦明顯低于食品中允許的最大添加量，提示在食品安全允許的范圍內(nèi)，添加Nisin能夠有效抑制芽孢桿菌的增殖生長(zhǎng)[10]。由于食醋腐敗在食醋釀造行業(yè)幾乎每年夏天都會(huì)發(fā)生，對(duì)食醋釀造生產(chǎn)企業(yè)造成了很大經(jīng)濟(jì)損失。本研究為食醋生產(chǎn)過(guò)程中利用Nisin取代化學(xué)防腐劑預(yù)防腐敗醋的發(fā)生提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究中分離到的微生物菌株并不一定都能夠引起食醋的腐敗，有關(guān)食醋腐敗的原因、條件、腐敗菌的組成等研究還有待進(jìn)一步開(kāi)展。構(gòu)建腐敗食醋中非培養(yǎng)微生物的克隆文庫(kù)[20-25]并開(kāi)展食醋變質(zhì)過(guò)程中微生物菌群多態(tài)性分析，將會(huì)進(jìn)一步為腐敗醋的防治工作提供有價(jià)值的指導(dǎo)。

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Inhibitory Effect of Nisin on Microorganisms Isolated and Identifi ed from Spoiled Vinegar

LI Weili1,2, ZHAO Chao1,2, CHE Jiantu1,2, LI Dongle1,2, YI Wuhua2, ZHAO Lijuan2
(1. Beijing S&V Science and Technology Co. Ltd., Beijing 102200, China; 2. Shanxi Shuita Vinegar Industry Co. Ltd., Qingxu 030400, China)

In the present study, 84 different bacterial strains were isolated from spoiled vinegar, which were identifi ed as 20 Bacillus amyloliquefaciens, 12 B. licheniformis, 6 Bacillus 1NLA3E, 12 Paenibacillus, 4 B. megaterium, 3 Brevibacillus brevis, 2 B. pumilus, 11 B. coagulans, 1 Lactobacillus acetotolerans and 1 Clostridium perfringens strains by morphological observation, 16S rDNA sequencing, and sequence alignment with GenBank database, as well as 16S-23S ITS sequencing. The inhibitory potency of nisin on these 84 bacterial strains was determined by assaying the diameter of inhibition zone using cup-plate method and turbidity using nephelometry, indicating that nisin had a signifi cant inhibitory activity on all the microbes isolated from the spoiled vinegar.

spoiled vinegar; 16S rDNA; 16S–23S ITS; isolation and identifi cation; Nisin

Q93

A

1002-6630（2015）01-0174-05

10.7506/spkx1002-6630-201501033

2014-03-11

李偉麗（1981—），女，中級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)、分子生物學(xué)。E-mail：liweili524@sina.com