重組谷氨酸脫羧酶大腸桿菌合成γ-氨基丁酸條件的優(yōu)化

陳 琳，張 充，呂鳳霞，別小妹，趙海珍，陸兆新

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

重組谷氨酸脫羧酶大腸桿菌合成γ-氨基丁酸條件的優(yōu)化

陳 琳，張 充，呂鳳霞，別小妹，趙海珍，陸兆新*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

研究重組谷氨酸脫羧酶大腸桿菌合成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的適宜條件。檢測溫度、pH值、表面活性劑、金屬離子、底物與菌體質量比以及反應體系體積對GABA轉化效率的影響。結果表明：最優(yōu)轉化條件為：轉化體系5 mL、底物L-谷氨酸鈉濃度0.1 mol/L、重組大腸桿菌細胞6.4 mg（干質量）、Triton-100體積分數(shù)0.06%、Ca2+濃度0.6 mmol/L，轉化溫度45 ℃、反應體系pH 4.5。在該體系下反應7 h，GABA合成量達到26.1 g/L，GABA轉化效率在1 h時達到最高，為13.8 g/（g?h），較優(yōu)化前提高1.5 倍。

γ-氨基丁酸；谷氨酸脫羧酶；轉化條件；優(yōu)化

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種主要的抑制性神經(jīng)遞質。GABA具有許多重要的生理功能，如降血壓[1]、預防癲癇[2]、抗抑郁[3]、抗疲勞[4]、控制哮喘[5]和促進激素分泌等。由于GABA具有諸多重要的生理功能，已經(jīng)發(fā)展成為一種新型的功能性因子，正逐漸被廣泛應用于食品保健、醫(yī)藥、化工及飼料[6]等領域。目前，國內外都在積極研發(fā)富含GABA的食品，己成功研發(fā)的有茶飲料、米胚芽、功能性飲料、乳制品和大豆發(fā)酵制品[7-9]。

微生物法制備GABA的優(yōu)點很多，如安全性較高、反應條件溫和、生產(chǎn)成本較低以及較好的商業(yè)化開發(fā)應用前景等，因此，近年來微生物法制備GABA受到國內外學者廣泛的關注，其中大腸桿菌、紅曲霉、釀酒酵母、乳酸菌等GABA生產(chǎn)菌種研究較為深入。已有很多研究證明乳酸菌具有合成GABA的能力[10-13]，乳酸菌作為一種有保健作用的益生菌，用其合成GABA越來越受到人們的青睞，目前用乳酸菌合成 GABA的研究主要集中在菌株的篩選、傳統(tǒng)誘變方法以及發(fā)酵條件優(yōu)化上，但是，由于乳酸菌具有發(fā)酵周期較長以及培養(yǎng)條件較難控制等缺點，在生產(chǎn)強度上處于劣勢，而借助基因工程手段構建高拷貝重組質粒，導入宿主菌，可以使谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）表達量提高，獲得高GAD活性的基因工程菌，從而縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)強度。

GABA對紫外、可見光及電化學都不靈敏，直接檢測GABA很困難。目前報道的有紙層析法[14]、薄層掃描法[15]、氨基酸分析儀法[16]、毛細管電泳法[17]、高效液相色譜[18]及氣相色譜-質譜法[19]等，其中高效液相色譜法可定量檢測GABA，相較氨基酸分析儀法成本低、分離時間短，是一種較為常用的方法。

谷氨酸脫羧酶基因gadB來源于菌株Streptococcus thermophilus Y2，將其與E. coli表達載體pET-23a連接構建重組表達載體，轉入E. coli，獲得gadB基因工程菌E. coli BL21（DE3）-[pET-23a-gadB][20]。利用該基因工程菌催化L-谷氨酸鈉生成GABA，通過研究溫度、pH值、表面活性劑、金屬離子、底物與菌體質量比以及反應體系體積對GABA轉化效率的影響，確定該菌株轉化合成GABA的最佳轉化條件，通過在此最佳轉化條件下合成GABA，以期提高GABA轉化效率，達到全細胞轉化法高效制備GABA的目的。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

Escherichia coli BL21（DE3）-[pET-23a-gadB]由南京農(nóng)業(yè)大學酶工程研究室保藏。

種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，加水溶解后，加去離子水定容到1 000 mL。使用時向其中添加經(jīng)過濾除菌的氨芐青霉素，抗生素終質量濃度為100 μg/mL。

GABA（純度≥99%）、丹磺酰氯 美國Sigma公司；曲拉通X-100 廣東光華科技股份有限公司；四氫呋喃（色譜純）、丙酮 上海凌峰化學試劑有限公司；冰乙酸（色譜純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醇（色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HYG-A全溫搖瓶柜 太倉實驗設備廠；AY120電子精密天平 日本Shimadzu公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進醫(yī)療器械廠；手提式蒸汽壓力滅菌器 上海醫(yī)用核子儀器廠；5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf基因公司；SW-CJ-IBU超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；Agilent 1100 series高效液相色譜系統(tǒng) 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 重組大腸桿菌細胞的制備

1.3.1.1 培養(yǎng)條件

轉接甘油凍存菌E. coli BL21（DE3）-[pET-23a-gadB]于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12～14 h至對數(shù)期備用，將種子液按3%的接種量接入300 mL的新鮮液體LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm= 0.6～0.8，加入誘導劑異丙基硫代半乳糖苷至其終質量濃度為0.1 μg/mL，16 ℃、180 r/min誘導16 h以上。

1.3.1.2 菌懸液的制備

將發(fā)酵液在4 ℃于8 000×g離心10 min，棄上清液，得到菌體沉淀。用9 g/L的生理鹽水重懸菌體2 次，按照10 倍濃縮發(fā)酵液的比例加入已滅菌的生理鹽水，反復吹打制得菌懸液，加入甘油置于－20 ℃冰箱中保存。

1.3.2 重組大腸桿菌細胞合成GABA轉化條件優(yōu)化

分別對轉化溫度、轉化pH值、表面活性劑處理、金屬離子處理、底物與菌體質量比、反應體系體積進行單因素優(yōu)化試驗，然后在最優(yōu)條件下測定轉化時間對GABA轉化效率的影響。

以26.55 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以3 mL菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調pH值為4.5作為標準反應體系，于37 ℃、180 r/min的恒溫搖床反應1 h，取上清液凍存待測。

1.3.3 GABA含量的測定

1.3.3.1 色譜條件[21-25]

GABA的高效液相色譜檢測條件：Agilent HC-C18柱（4.6 mm×250 mm，0.5 μm）；進樣量：20 μL；柱溫：35 ℃；紫外檢測波長：254 nm；流速：0.6 mL/min；檢測時間：45 min；流動相：A相為甲醇，B相為四氫呋喃-甲醇-0.05 mol/L乙酸鈉（pH 6.2，體積比5∶75∶420）。

1.3.3.2 樣品處理及衍生化

取冰箱中保存的待測樣品20 μL，用0.1 mol/L（pH 9.8）的碳酸氫鈉緩沖液稀釋10 倍，然后加入0.2 mL等量的（4 g/L）丹磺酰氯（1-二甲氨基-萘-5-磺酰氯，DNS-Cl）丙酮溶液，置于37 ℃條件下避光衍生化反應1 h，DNS-Cl能與氨基酸的一級胺、二級胺、巰基、咪唑基和酚羥基縮合，生成DNS-GABA衍生物，衍生結束后過0.22 μm濾膜待測。

2 結果與分析

2.1 最適預處理溫度與時間

在轉化之前，把菌體在55、60 ℃分別處理1.5、3、6、12、24 h，并設置未加熱處理對照組。在29.55 mL反應體系中，以26.55 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以3 mL菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調pH值為4.5，在37 ℃條件下反應2 h，測定在不同溫度與不同時間熱處理條件下GABA轉化效率。如圖1所示，菌體經(jīng)過熱處理后，GABA轉化效率明顯提高，其中效果最好為55 ℃處理1.5 h，GABA轉化效率由3.6 g/（g?h）提高到8.0 g/（g?h），提高了1.2 倍。55 ℃處理1.5～24 h時GABA轉化效率均高于對照組，說明熱處理對GABA轉化效率的提高具有促進作用，原因可能是熱處理使得菌體細胞結構更加疏松，有利于與底物充分進行反應，使得GABA轉化效率提高。以55、60 ℃條件對菌體進行熱處理，GABA轉化效率均隨處理時間的增加而降低，這是由于熱處理時間的增加會導致工程菌中GAD酶活性的下降，從而降低GABA轉化效率。

圖1 熱處理對GABA轉化效率的影響Fig.1 Effect of heat treatment on the productivity of GABA

2.2 最適轉化溫度

圖2 轉化溫度對GABA轉化效率的影響Fig.2 Effect of temperature on the productivity of GABA

實驗選取28～55 ℃進行研究，在29.55 mL反應體系中，以26.55 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以3 mL菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調pH值為4.5，在不同溫度下反應1 h，測定在不同溫度下GABA轉化效率。如圖2所示，GABA轉化效率隨著轉化溫度的升高而升高，在45 ℃達到最高，GABA轉化效率為6.1 g/（g?h），45 ℃以后GABA轉化效率隨著轉化溫度的升高而降低，可能是因為溫度過高使得GAD酶活性下降，可見GAD催化合成GABA的最適轉化溫度為45 ℃。

2.3 最適轉化pH值

研究認為GAD賦予微生物細胞對酸性環(huán)境的抵抗能力，微生物在缺氧、酸性等不利條件下，GAD催化酸性谷氨酸變成中性GABA，進而維持細胞處于pH值較穩(wěn)定的環(huán)境中[26]。實驗選取pH 3.0～5.0進行研究，在29.55 mL反應體系中，以26.55 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以3 mL菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調節(jié)不同pH值，在37 ℃條件下反應1 h，測定在不同pH值條件下GABA轉化效率。

圖3 轉化pH值對GABA轉化效率的影響Fig.3 Effect of pH on the productivity of GABA

如圖3所示，GABA轉化效率隨著pH值的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，pH值為4.5時GABA轉化效率達到最大，為6.25 g/（g?h），可見pH 4.5時GAD酶活性最高，與已報道的微生物來源的GAD反應最適pH 3.8～5.0之間[27]基本一致。pH值在3.0、3.5時，GABA轉化效率很小，可能是pH值過低抑制了GAD酶活性及細胞的通透性，繼而影響GABA的轉化效率。

2.4 不同表面活性劑對GABA轉化效率的影響

表面活性劑可以增加細胞的通透性，同時表面活性劑也可能是酶的促進劑或抑制劑。實驗選取了表面活性劑十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、吐溫-80和Triton-100進行處理。

圖4 不同表面活性劑對GABA轉化效率的影響Fig.4 Effect of surfactants on the productivity of GABA

在29.55 mL反應體系中，以26.55 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以3 mL菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調pH值為4.5，在37 ℃條件下反應30 min，測定在不同表面活性劑處理下GABA轉化效率。如圖4所示，吐溫-80對 GABA的合成具有抑制作用，SDS嚴重抑制了GABA的合成。Triton-100對GABA的合成具有促進作用，因此選取Triton-100作為GABA合成促進因子，并對其添加量進行優(yōu)化。

測定添加不同Triton-100添加量處理下GABA轉化效率，如圖5所示，在Triton-100體積分數(shù)小于0.02%時，GABA轉化效率隨著Triton-100添加量的增加而升高，在Triton-100體積分數(shù)大于0.02%時GABA轉化效率增加較為緩慢并趨于穩(wěn)定，在Triton-100體積分數(shù)為0.06%時，GABA轉化效率達到最高，為12.6 g/（g?h），提高了1.3 倍，效果顯著，因此Triton-100添加的最適體積分數(shù)為0.06%。

圖5 Triton-100添加量對GABA轉化效率的影響Fig.5 Effect of Triton-100 concentration on the productivity of GABA

2.5 不同金屬離子對GABA轉化效率的影響

金屬離子可能是酶活性中心的組成部分，可以與酶螯合成絡合物以維持酶三級、四級結構及蛋白質分子構象穩(wěn)定，也可能是和底物結合催化反應有關[28]。為了考察金屬離子對GABA轉化效率的影響，本實驗探討Mg2+、Ca2+、Ba2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+、Fe2+、Co2+、Zn2+、Fe3+10 種金屬離子對GABA轉化率的影響，這些金屬離子分別來自于MgCl2、CaCl2、BaCl2、MnCl2、NiCl2、CuCl2、FeCl2、CoCl2、ZnCl2、FeCl3，濃度分別選取5、50 mmol/L。

在29.55 mL反應體系中，以26.55 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以3 mL菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調pH值為4.5，在37 ℃條件下反應1 h，測定在不同金屬離子處理下GABA轉化效率。

圖6 不同金屬離子對GABA轉化效率的影響Fig.6 Effect of metal ions on the productivity of GABA

如圖6所示，10 種金屬離子添加量為50 mmol/L時均對GABA的合成具有抑制作用，說明高濃度的金屬離子可能對微生物細胞具有損傷作用。金屬離子添加量為5 mmol/L時，Mg2+、Co2+、Fe2+、Fe3+、Ca2+對GABA的合成具有抑制作用，Ba2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+對GABA的合成有促進作用，其中Cu2+、Ni2+效果明顯。在植物中，GAD被認為是感受Ca2+信號的壓力調節(jié)伴侶蛋白，敲除CaM結合區(qū)域將會導致GAD活性的下降，并會嚴重影響植物的發(fā)育[26]，細菌GAD結構特征類似于植物[29]，為了研究細菌GAD受Ca2+激活是否類似于植物GAD，測定Ca2+、Cu2+、Ni2+3 種離子添加量為低濃度時對GABA轉化效率的影響。

圖7 Cu2+、Ni2+濃度對GABA轉化效率的影響Fig.7 Effects of Cu2+2+and Ni2+2+concentrations on the productivity of GABA

圖8 Ca 8 Ca2+2+濃度對GABA轉化效率的影響Fig.8 Effect of Ca2+2+concentration on the productivity of GABA

測定Ca2+、Cu2+、Ni2+3 種金屬離子在不同濃度添加量下GABA轉化效率。如圖7、8所示，GABA轉化效率隨著3 種金屬離子濃度的增加均呈先增加后減小趨勢，但最適濃度不一致，其中促進效果最好的為Ca2+，最適濃度為0.6 mmol/L，GABA轉化效率從6.0 g/（g?h）增加到9.2 g/（g?h），提高了53.3%；其次為Ni2+，最適濃度為6 mmol/L，GABA轉化效率提高了28.0%；再次為Cu2+，最適濃度為10 mmol/L，GABA轉化效率提高了21.8%。

2.6 最適底物與菌體質量比

圖9 底物與菌體質量比對GABA轉化效率的影響Fig.9 Effect of mass ratio between substrate and bacterial cells on the productivity of GABA

在29.55 mL反應體系中，以26.55 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以不同體積菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調pH值為4.5，在37 ℃反應1 h，測定底物與菌體不同質量比條件下GABA轉化效率。如圖9所示，GABA轉化效率隨著底物與菌體質量比增加呈先增加后減小的趨勢，在底物與菌體質量比為9∶1時GABA轉化效率最大，達到5.6 g/（g?h），因此選取9∶1為最適底物與菌體質量比。

2.7 最適反應體系體積

保持底物質量與菌體質量比為9∶1，設置反應轉化液不同體積：5、10、15、20、25、30、35 mL，以濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以不同體積菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調pH值為4.5，在37 ℃條件下反應1 h，測定在不同反應體系體積下GABA轉化效率。如圖10所示，GABA轉化效率隨著反應體系體積的增加而降低，原因可能是反應體系體積小時，菌體與底物的接觸機會較多，轉化效率高。當反應體系體積大于25 mL時，GABA轉化效率下降較為緩慢，趨勢趨于平穩(wěn)。因此，選取5 mL為最適反應體系。

圖10 反應體系體積對GABA轉化效率的影響Fig.10 Effect of reaction system volume on the productivity of GABA

2.8 最優(yōu)條件下反應時間對GABA轉化效率的影響

為了探索轉化時間對GABA產(chǎn)量和轉化效率的影響，研究1～10 h不同轉化時間下GABA轉化效率和合成量的變化。

圖11 轉化時間對GABA轉化效率和合成量的影響Fig.11 Effect of reaction time on the productivity and yield of GABA

由上述單因素優(yōu)化試驗得出最佳反應條件組合：以5 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以6.4 mg菌體為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調pH值為4.5，在反應體系中加入體積分數(shù)為0.06%的Triton-100，并加入濃度為0.6 mmol/L的Ca2+，在45 ℃條件下反應10 h。由圖11可知，GABA轉化效率隨著轉化時間的增加而減小，1～4 h，GABA轉化效率下降較為明顯，4～10 h，GABA轉化效率下降較為緩慢，1 h時GABA轉化效率最高，達到13.8 g/（g?h），優(yōu)化前GABA轉化效率為5.6 g/（g?h），優(yōu)化后使得GABA轉化效率提高1.5 倍，優(yōu)化效果較好。

GABA合成量隨著反應時間的增加呈先增加后減小趨勢，GABA合成量在1 h時增加最多，達到16.0 g/L，1～7 h GABA合成量緩慢增加，反應時間為7 h時GABA合成量最高，為26.1 g/L，7 h以后GABA合成量緩慢減小，可能是由于隨著反應時間的增加，底物和菌體均會減少，而產(chǎn)物GABA逐漸積累，反應一定時間后，底物被消耗完全，且產(chǎn)物 GABA被反應體系中某些物質消耗，從而導致GABA合成量的減小。

3 結 論

本研究利用實驗室保藏的菌株E. coli BL21（DE3）-[pET-23a-gadB]進行全細胞轉化，該菌株是高效表達GAD的基因工程菌，本菌株打破了乳酸菌野生菌株GAD本底表達量不高所導致的全細胞轉化效率不高的限制，借助大腸桿菌GAD表達具有可人工調控、生長迅速以及易于高密度培養(yǎng)等頗多優(yōu)點，達到高效率生產(chǎn)GABA的目的。

本實驗對重組谷氨酸脫羧酶細胞生物合成GABA轉化條件進行了優(yōu)化，最終得到最佳轉化條件為：以5 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以6.4 mg菌體為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調pH值為4.5，在反應體系中加入體積分數(shù)為0.06%的Triton-100，并加入濃度為0.6 mmol/L的Ca2+，在45 ℃條件下反應7 h，GABA合成量達到26.1 g/L。王期等[30]利用工程菌粗酶液以L-谷氨酸鈉為底物催化合成GABA，GABA生成量達到19.57 g/L，本實驗所得到的GABA生成量略高于此研究。

GABA轉化效率在1 h時達到最高，為13.8 g/（g?h），優(yōu)化前GABA轉化效率為5.6 g/（g?h），優(yōu)化后使得GABA轉化效率提高1.5 倍，優(yōu)化條件中pH值對GABA轉化效率影響較大，因此控制底物轉化液pH值較為關鍵，pH值過高或過低均不利于GABA的生成，因pH值過高或過低均會影響酶活性。此外，添加低濃度的表面活性劑Triton-100對GABA轉化效率的提高效果顯著，最佳添加量為0.06%，GABA轉化效率較對照組提高1.3 倍，這可能是因為Triton-100增加了細胞膜的通透性，使得底物更易進入細胞內進行反應，而產(chǎn)物GABA更易透過細胞膜進入細胞外。本實驗主要考察了單因素對GABA轉化效率的影響，未對因素間的交互作用做出研究，還有待進一步探索。

田靈芝等[31]利用重組谷氨酸脫羧酶大腸桿菌合成GABA，在最優(yōu)條件下，批次添加底物L-谷氨酸共600 g，5 L發(fā)酵罐轉化24 h，GABA累計質量濃度高達204.5 g/L，以物質的量計，轉化率為 97.92%，說明用發(fā)酵罐生產(chǎn)GABA的產(chǎn)量很高，因此本課題組下一步研究將在發(fā)酵罐的水平上進行。

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Optimization of Conversion Conditions for Biosynthesizing γ-Aminobutyric Acid by Recombinant Glutamate Decarboxylase from Escherichia coli

CHEN Lin, ZHANG Chong, Lü Fengxia, BIE Xiaomei, ZHAO Haizhen, LU Zhaoxin*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The conditions for the synthesis of γ-aminob utyric acid (GABA) using glutamate decarboxylase from recombinant E. coli cells were optimized in this work. The effects of temperature, pH, surfactants, metal ions, the ratio of substrate and cells and the transformation system volume on the productivity of GABA were studied. Results indicated that the optimal reaction system volume was 5 mL containing 0.1 mol/L sodium glutamate as the substrate, 6.4 mg of E. coli cells (dry weight), 0.06% Triton-100 (volume fraction) and 0.6 mmol/L Ca2+at pH 4.5. The reaction was allowed to proceed for 7 h at 45 ℃. Under these optimal conditions, the yield of GABA was 26.1 g/L. The transformation effi ciency of GABA reached the highest level of 13.8 g/(g·h) after 1 h reaction, which is 2.5 times higher than that observed before optimization.

γ-aminobutyric acid (GABA); glutamate decarboxylase; conversion conditions; optimization

Q939.9

A

1002-6630（2015）01-0158-06

10.7506/spkx1002-6630-201501030

2014-03-03

陳琳（1991—），女，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：2013108025@njau.edu.cn

*通信作者：陸兆新（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品微生物及生物技術。E-mail：fmb@njau.edu.cn