伊曲康唑促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬的作用及機(jī)制研究

鐘曉輝，李靈玲

1.廣漢市人民醫(yī)院 藥劑科（廣漢 618300）；2.成都市計劃生育指導(dǎo)所（成都 610000）

結(jié)腸癌是我國高發(fā)癌癥之一，目前主要通過手術(shù)和化學(xué)藥物治療，但預(yù)后情況不容樂觀，迫切需要尋找新的治療藥物。近年來，自噬成為結(jié)腸癌腫瘤治療的新靶點，研究［1］表明，自噬性細(xì)胞死亡可能抑制腫瘤新生血管形成，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移；同時，自噬也可以增強(qiáng)以細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為靶點的抗結(jié)腸癌藥物作用。伊曲康唑是三唑類抗真菌藥物，通過抑制14－α－羊毛甾醇脫甲基酶來阻抑真菌中麥角固醇以及哺乳動物中膽固醇的從頭合成［2］。近年來研究［3－5］發(fā)現(xiàn)，伊曲康唑是一種有效的細(xì)胞自噬促進(jìn)劑，能夠抑制PI3K－AKT－mTOR信號通路，通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬顯著抑制成神經(jīng)管細(xì)胞瘤以及非小細(xì)胞肺癌的生長，它有望成為一種潛在的抗結(jié)腸癌腫瘤藥物。本研究通過對伊曲康唑與結(jié)腸癌細(xì)胞自噬關(guān)系的研究，以了解伊曲康唑潛在的抗腫瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，于－80℃凍存；伊曲康唑、噻唑藍(lán)（MTT）、雷帕霉素（RAPA）、Hoechst 33342購買于Sigma公司；AKT、mTOR、Stat3抗體及其磷酸化抗體購于Cell Signal Technology公司，其余抗體購自Santa Cruz公司；細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco公司；PVDF膜和ECL顯影液購于 Millpore公司；X光膠片購于Kodak公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SW480在含10% 胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中（100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素）于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞增殖情況 將100μL細(xì)胞懸液以50 000個/mL的密度接種于96孔板，在CO2孵箱中37℃培養(yǎng)孵育過夜。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的藥物100μL繼續(xù)培養(yǎng)36h，每組設(shè)4個復(fù)孔，另設(shè)不含細(xì)胞僅有培養(yǎng)基的空白孔為空白對照孔。藥物處理結(jié)束后，加入 MTT（5mg/mL）試劑20μL，37℃5%CO2孵育4h，以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀檢測590nm波長下的吸光值。

1.2.3 Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡情況 將SW480細(xì)胞以10 000個/mL每孔鋪在經(jīng)多聚賴氨酸處理過的蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后，配置不同濃度的伊曲康唑培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36h。去培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗兩次，4% 多聚甲醛固定15min，去固定液，PBS洗兩次，加入Hoechst 33342染液1mL，染色10min，PBS洗兩次，5min/次，加入熒光猝滅劑，封片。熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 克隆形成實驗 將SW480細(xì)胞以100個/孔的量接種至6孔板中，24h后使用不同濃度的伊曲康唑處理細(xì)胞。37℃，5%CO2下培養(yǎng)細(xì)胞兩周，每3d更換一次培養(yǎng)基。棄培養(yǎng)基，PBS洗兩次，甲醇固定5min，結(jié)晶紫染色15min，PBS洗兩次后，觀察并統(tǒng)計克隆數(shù)。

1.2.5 LC3免疫熒光標(biāo)記檢測自噬體的形成 參考文獻(xiàn)［6］，將細(xì)胞鋪在經(jīng)多聚賴氨酸處理過的蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后，配置不同濃度的伊曲康唑培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。通過LC3抗體免疫熒光檢測細(xì)胞體內(nèi)自噬體的形成。

1.2.6 免疫印跡檢測 收集經(jīng)藥物處理后的細(xì)胞，按1×106細(xì)胞濃度加入100μL細(xì)胞裂解液，震蕩，冰上放置1h，4℃，13 000r/min離心15min，取上清液加上樣緩沖液，85℃加熱變性10min，樣品中蛋白經(jīng)BCA試劑盒定量，以確保蛋白上樣量一致。通過15%SDS－PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。分別加入一抗（稀釋比例1∶1 000），4℃孵育過夜。用TBST洗膜后，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶5 000），37℃孵育1h，TBST 洗滌PVDF膜5次，10min/次，加入ECL顯影劑后，通過X光膠片曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

MTT實驗數(shù)據(jù)記錄為590nm處的光吸收值，克隆形成實驗中數(shù)據(jù)為細(xì)胞克隆個數(shù)。采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間數(shù)據(jù)比較采用成組設(shè)計t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 伊曲康唑抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖

使用不同濃度的伊曲康唑處理結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 36h后，通過MTT實驗檢測細(xì)胞活力。伊曲康唑顯著抑制細(xì)胞增殖速率，并且抑制程度呈濃度依賴性。此外，克隆形成實驗結(jié)果表明，與二甲基亞砜（DMSO）處理組相比，伊曲康唑處理組的克隆數(shù)明顯減少，并且克隆數(shù)和伊曲康唑的濃度呈負(fù)相關(guān)（圖1、圖2）。

圖1 不同濃度伊曲康唑處理SW480細(xì)胞36h的抑制率

圖2 克隆形成實驗檢測SW480細(xì)胞增殖

2.2 伊曲康唑促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬

使用Hoechst法檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明，2μM 和5μM 伊曲康唑處理對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480凋亡無明顯影響。進(jìn)一步檢測伊曲康唑?qū)ζ渌c細(xì)胞生存死亡相關(guān)的生物學(xué)過程的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過2μM和5μM伊曲康唑處理細(xì)胞24h后，顯微鏡下觀察，細(xì)胞出現(xiàn)了大量囊泡，懷疑細(xì)胞出現(xiàn)的囊泡為自噬泡。通過免疫熒光檢測LC3表達(dá)情況，伊曲康唑促進(jìn)SW480細(xì)胞內(nèi)LC3的表達(dá)，經(jīng)過12、24、36h3個時間段的觀察，5μM 伊曲康唑處理細(xì)胞36h時，胞內(nèi)LC3熒光斑點數(shù)最多。此外，Western blot檢測3個時間段經(jīng)過藥物處理后胞內(nèi)LC3活化情況，其結(jié)果與免疫熒光結(jié)果相符，5μM伊曲康唑處理36h時，胞內(nèi)LC3活化效果最為明顯。Western blot檢測經(jīng)5μM伊曲康唑處理36h時胞內(nèi)自噬相關(guān)標(biāo)志性蛋白（P62、beclin－1）的表達(dá)情況，結(jié)果表明，伊曲康唑抑制P62和beclin－1的表達(dá)。因此，可以得出，伊曲康唑促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480自噬（圖3、圖4、圖5、圖6和圖7）。

圖3 Hoechst檢測SW480細(xì)胞凋亡

圖4 光鏡下觀察SW480細(xì)胞的形態(tài)變化

圖5 LC3免疫熒光實驗

圖6 免疫印跡檢測LC3的表達(dá)

圖7 免疫印跡檢測自噬標(biāo)志蛋白

2.3 伊曲康唑抑制細(xì)胞內(nèi)mTOR信號通路

自噬復(fù)雜的生物學(xué)過程涉及到外部環(huán)境的刺激和細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵分子事件的變化，PI3K－AKT－mTOR通路是自噬最重要的上游調(diào)控因子［7］。在饑餓、低氧以及某些化療藥物處理的情況下，PI3K－AKT－mTOR通路被抑制，進(jìn)而導(dǎo)致一系列自噬相關(guān)基因（Atg）的級聯(lián)激活，最終誘發(fā)自噬［8－9］。Western blot結(jié)果表明，5μM伊曲康唑顯著抑制了胞內(nèi)AKT和mTOR的磷酸化水平。同時，采用mTOR特異性抑制劑RAPA［17］和伊曲康唑共同處理細(xì)胞，結(jié)果表明，伊曲康唑特異性抑制了胞內(nèi)mTOR信號通路，進(jìn)而促進(jìn)了SW480細(xì)胞自噬（圖8）。

圖8 免疫印跡分析AKT和mTOR

3 討論

自噬是受到Atg嚴(yán)格調(diào)控的一種細(xì)胞程序性死亡模式，細(xì)胞自噬是亞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生動態(tài)變化，并經(jīng)溶酶體介導(dǎo)，對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的過程［10］。自噬體通過包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，在溶酶體酶的作用下降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細(xì)胞本身的能量代謝需要和某些細(xì)胞器的更新［11－12］。隨著腫瘤進(jìn)展階段的不同，自噬所扮演的角色也不盡相同。在腫瘤發(fā)生早期，腫瘤細(xì)胞快速增殖生長，合成代謝速率明顯大于分解代謝速率［13］，此時，自噬發(fā)揮腫瘤抑制作用，可降低蛋白降解速率，導(dǎo)致癌前細(xì)胞的持續(xù)生長［14］。當(dāng)腫瘤細(xì)胞持續(xù)分裂增殖呈進(jìn)展階段時，自噬幫助處于實體腫瘤內(nèi)部的癌細(xì)胞抵抗缺氧、低營養(yǎng)狀態(tài)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活。此外，在抗腫瘤治療中，自噬也發(fā)揮著雙重作用。一方面保護(hù)某些腫瘤細(xì)胞免受放療、化療損傷［15－16］，另一方面介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡［17］。

伊曲康唑于1984年發(fā)明，是一種三唑類抗真菌藥物，對淺表和深部真菌均有抗菌作用［18］，適用于真菌感染的病人。伊曲康唑的作用機(jī)制與其他氮唑類抗真菌藥物一樣，抑制細(xì)胞膜色素P450氧化酶介導(dǎo)的麥角固醇的合成［19］，而不同之處在于，伊曲康唑還能夠抑制刺猬信號通路以及血管發(fā)生［20］。最新研究［21］顯示，伊曲康唑能夠顯著抑制成神經(jīng)管細(xì)胞瘤以及非小細(xì)胞肺癌的生長，這些研究成果提示，伊曲康唑有望成為一種新的抗腫瘤藥物，但是其抗腫瘤的分子機(jī)制還有待闡明。

伊曲康唑能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，并導(dǎo)致出現(xiàn)一系列促進(jìn)自噬標(biāo)志的事件，包括細(xì)胞內(nèi)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體增加以及LC3－I向LC3－Ⅱ的轉(zhuǎn)換增強(qiáng)。在自噬過程中，隔離膜的形成依賴于Ⅲ型PI3K激活，誘導(dǎo)PtdIns生成PI3P，而beclin 1/Ⅲ型PI3K復(fù)合物的形成又是使Ⅲ型PI3K復(fù)合物具有活性的必要前提［22］，mTOR通過對其下游靶點p70S6K和4E－BP1的調(diào)節(jié)來促進(jìn)細(xì)胞增殖和生長［23］。因此，伊曲康唑?qū)TOR信號通路的阻抑作用可以很好地解釋其抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的現(xiàn)象。考慮到mTOR途徑是自噬上游最重要的調(diào)節(jié)因子，伊曲康唑?qū)TOR磷酸化水平的抑制作用表明，mTOR通路在伊曲康唑介導(dǎo)自噬的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。

最新報道［24］稱，膽固醇合成及脂代謝與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。研究［25］表明，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的減少會激發(fā)自噬。伊曲康唑以及其他一些吡咯類抗真菌藥物都能夠有效抑制真菌中催化麥角固醇生物合成的酶類，而且在高濃度條件下，也能夠抑制哺乳動物細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，2μM和5μM伊曲康唑能誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬，而文獻(xiàn)［27］報道稱，伊曲康唑減少總膽固醇含量的最低濃度卻是20μM，這些結(jié)果表明，低濃度伊曲康唑介導(dǎo)的細(xì)胞自噬并不是由于總膽固醇含量降低造成，提示低濃度伊曲康唑促進(jìn)細(xì)胞自噬可能還存在其他分子機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

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