GLI1和MMP9在胰腺癌中的表達(dá)及其臨床意義的研究

大連醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院(116044)陳文政 劉國才 臧 輝 遲海波

遼寧省人民醫(yī)院普外科 柳青峰*

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科 盛偉偉

近年來胰腺癌的發(fā)病率逐年上升，美國癌癥協(xié)會(huì)在2014年發(fā)布的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2014年全美新增46 420例罹患胰腺癌，其中有39 590例當(dāng)年死于該疾病，病死率高達(dá)85.29%。其發(fā)病率在惡性腫瘤中位居第10位，病死率列第4位［1］。根據(jù)全國腫瘤防治研究辦公室發(fā)表的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我國胰腺癌發(fā)病率和病死率均比世界平均水平要高［2］。胰腺癌的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，并且缺乏特異性的臨床癥狀和早期診斷試驗(yàn)，容易發(fā)生胰周侵襲和遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移，進(jìn)展迅速，惡性程度高，預(yù)后差，5年生存率不足5.00%。

膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1(GLI1)是Hedgehog信號(hào)通路中最關(guān)鍵的信號(hào)分子，是Shh信號(hào)通路激活的標(biāo)記基因［3］，能夠激活下游基因轉(zhuǎn)錄和翻譯［4］。近年來相關(guān)研究表明，多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展都和Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路的突變和異?；罨嘘P(guān)。在胰腺癌發(fā)病過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)既能降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，又能使組織結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑并且能夠誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成而導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移［5］。本研究采用免疫組織化學(xué)SP法檢測48例原發(fā)性胰腺癌和11例正常胰腺組織中GLI1和MMP9的表達(dá)，探討兩者的表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取遼寧省人民醫(yī)院和中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2009年12月至2012年11月行根治性手術(shù)切除的石蠟包埋胰腺癌組織標(biāo)本48例。其中遼寧省人民醫(yī)院17例，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院31例。男26例，女22例。年齡37～76歲，平均(58.6±6.1)歲。這些病例均經(jīng)組織病理學(xué)診斷為原發(fā)性胰腺導(dǎo)管腺癌，其中高分化腺癌26例、中分化腺癌17例、低分化腺癌5例。同時(shí)選取正常胰腺組織標(biāo)本11例。所有病例均無其他嚴(yán)重內(nèi)科疾病或惡性腫瘤，術(shù)前均未行放化療和細(xì)胞免疫治療。收集時(shí)均獲得患者的知情和同意并且留有確切的聯(lián)系電話進(jìn)行電話隨訪。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第6版標(biāo)準(zhǔn)［6］進(jìn)行TNM分期。

1.2 免疫組化檢測 標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)4μm厚度常規(guī)切片。除做常規(guī)HE染色外，余做免疫組化染色。步驟嚴(yán)格按照SP試劑盒的說明書操作。將已知GLI1、MMP9陽性切片作陽性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 染色結(jié)果判定

1.3.1 GLI1染色結(jié)果判定 l)染色強(qiáng)度:(+)弱陽性，記為1分;)中等強(qiáng)度，記為2分;)強(qiáng)陽性，記為3分。2)陽性細(xì)胞百分比:比例＜5%，記為0分;比例5%～25%，記為1分;比例26%～50%，記為2分;比例51%～75%，記為3分;比例＞75%，記為4分。3)將染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比兩者得分相乘，如果乘積＜6為低表達(dá)，介于7～12為高表達(dá)。

1.3.2 MMP9染色結(jié)果判定 在10×20高倍視野下，從每一張組織切片中隨機(jī)選取10個(gè)視野，單個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，10個(gè)視野總計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。按陽性表達(dá)細(xì)胞占所有計(jì)數(shù)細(xì)胞的比例計(jì)算百分率，＜5%細(xì)胞著色標(biāo)為(-)，5%～25%細(xì)胞著色標(biāo)為(+)，25%～50%細(xì)胞著色標(biāo)為)，＞50%細(xì)胞著色標(biāo)為)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用卡方檢驗(yàn)及Fisher確切概率法評(píng)估GLI1、MMP9與臨床病理因素之間的關(guān)系，采用Spearman分析對(duì)GLI和MMP9進(jìn)行相關(guān)性分析，采用Kaplan-Meier法描繪生存曲線，組間生存率比較用Log-Rank檢驗(yàn)，不同影響因素與胰腺癌預(yù)后采用Cox多因素分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 隨訪結(jié)果 采用電話對(duì)48例患者進(jìn)行隨訪，時(shí)間2年在此期間死于胰腺癌相關(guān)疾病者為完全數(shù)據(jù)，生存和失訪病例按刪失數(shù)據(jù)處理。生存時(shí)間按月計(jì)算，以手術(shù)日至末次隨訪所得的時(shí)間為準(zhǔn)。失訪1例，3例術(shù)后意外死亡計(jì)入失訪，失訪率為8.3%，4例依然存活(8.3%)。

2.2 免疫組化結(jié)果 GLI1在48例胰腺癌組織中共有32例呈高表達(dá)，染色著色位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核;MMP9在48例胰腺癌組織中共有30例呈陽性表達(dá)，染色顆粒著色位于細(xì)胞漿;兩者在11例正常胰腺組織中各有1例表達(dá);GLI1、MMP9在胰腺癌組織和正常組織中的表達(dá)差異具有顯著性，P＜0.05。GLI1的高表達(dá)和MMP9的陽性表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤部位和切緣狀況無關(guān)，P＞0.05，差異無顯著性;與腫瘤大小、分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、局部浸潤和有無神經(jīng)侵犯有關(guān)，P＜0.05，差異具有顯著性，見表1。

2.3 GLI1、MMP9的表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系GLI1高表達(dá)患者中位生存時(shí)間為11.5個(gè)月，1年累計(jì)生存率為50.4%，GLI低表達(dá)患者中位生存時(shí)間16.9個(gè)月，1年累計(jì)生存率為78.6%。生存曲線結(jié)果(見圖1)表明，GLI1高表達(dá)者生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)者(Log-rank檢驗(yàn)，Χ2=12.230，P=0.000)。MMP9陽性表達(dá)患者中位生存時(shí)間為12.8個(gè)月，1年累計(jì)生存率為53.3%，MMP9陰性表達(dá)患者中位生存時(shí)間16.6個(gè)月，1年累計(jì)生存率為83.3%。生存曲線結(jié)果(見圖2)表明，MMP9陽性表達(dá)者生存時(shí)間明顯低于陰性表達(dá)者(Log-rank檢驗(yàn)，Χ2=4.077，P=0.043)。

2.4 胰腺癌中GLI1與MMP9表達(dá)的相關(guān)關(guān)系 將GLI1和MMP9的染色性質(zhì)作為變量，使用Spearman分析兩者的相關(guān)性。結(jié)果表明，GLI1與MMP9的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.548，P=0.000)，見表2。

2.5 不同影響因素與胰腺癌預(yù)后的Cox多因素分析將腫瘤部位、切緣狀況、腫瘤大小、腫瘤分化、T分期、TNM分期、周圍神經(jīng)侵犯、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、MMP9陽性表達(dá)、GLI1高表達(dá)等可能影響患者預(yù)后的因素強(qiáng)制引入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，進(jìn)行多因素分析(回歸模型的Χ2=52.496，P=0.018，模型具有意義)。結(jié)果表明，切緣狀況(P=0.027)、TNM分期(P=0.023)、周圍神經(jīng)侵犯(P=0.016)、血管侵犯(P=0.019)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.025)、MMP9陽性表達(dá)(P=0.038)、GLI1高表達(dá)(P=0.041)為影響胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立因素，見表3。

圖1 GLI 1生存曲線

表1 GLI1和MMP9的表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

圖2 MMP9生存曲線

表2 胰腺癌中GLI1與MMP9表達(dá)的相關(guān)關(guān)系

表3 不同影響因素與胰腺癌預(yù)后的Cox多因素分析

3 討論

Hedgehog(Hh)信號(hào)傳導(dǎo)通路異常會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，諸多研究表明，在多種腫瘤(如肝癌、胃癌、胰腺癌、皮膚基底細(xì)胞癌等)的發(fā)生和發(fā)展過程中，Hh信號(hào)傳導(dǎo)通路也有重要的作用［6-10］。Hh信號(hào)傳導(dǎo)通路在胰腺癌中主要是以Hh-GLI1通路的形式存在，其過度激活將導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展。Xuanfu Xu［11］等研究發(fā)現(xiàn)，GLI1基因能夠基因調(diào)控TGFβ、Ras、Wnt、生長因子、PI3K/AKT、整合素、TMS4和S100A4等因子，當(dāng)GLI1基因表達(dá)升高時(shí)，E鈣蛋白表達(dá)下降，以此介導(dǎo)EMT(上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化)，促進(jìn)胰腺癌的肝轉(zhuǎn)移和脾內(nèi)微小轉(zhuǎn)移。王鋒［12］等通過干擾胰腺癌細(xì)胞GLI1基因表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，隨著GLI1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的下調(diào)，bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)也下調(diào)，表明干擾GLI1基因的表達(dá)可能通過下調(diào)bcl-2的表達(dá)抑制人胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖。

本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測GLI1在胰腺癌中的表達(dá)，從組織學(xué)角度來闡明GLI1和胰腺癌的關(guān)系。結(jié)果GLI1在48例胰腺癌組織中共有32例呈高表達(dá)，并且和腫瘤大小、分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、局部浸潤和有無神經(jīng)侵犯有關(guān)，說明GLI1和胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要關(guān)系，并且能夠促進(jìn)胰腺癌組織的侵襲和轉(zhuǎn)移。

MMP9能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和組織的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成［13-14］。MMP9通過降解主要成分為IV型膠原的基底膜，使基底膜的連續(xù)性和完整性受到破壞，從而有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［15］。MMP9和胰腺癌的發(fā)生及發(fā)展具有重要關(guān)系。尚培中［16］等應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測MMP9在70例原發(fā)性胰腺癌行根治性手術(shù)切除的組織標(biāo)本和15例癌旁正常胰腺組織中的表達(dá)，結(jié)果表明，MMP9在原發(fā)性胰腺癌組織中的表達(dá)和在癌旁正常胰腺組織中的表達(dá)差異有顯著性(P＜0.05);MMP9表達(dá)與患者的性別、年齡及腫瘤部位無關(guān)而與腫瘤大小、分化程度、TNM分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著關(guān)系。本研究也表明，MMP9與腫瘤大小、分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、局部浸潤和有無神經(jīng)侵犯有關(guān)。

GLI1能否調(diào)節(jié)MMP9來調(diào)控腫瘤細(xì)胞和組織的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。歐陽小波［17］等采用免疫組織化學(xué)方法檢測Shh、GLI1和MMP9蛋白在胃癌組織中的表達(dá)來研究它們與胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果表明，胃癌組織中Shh、GLI1和MMP9的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織和正常組織，并且三者的表達(dá)均與胃癌患者的性別、年齡、部位無關(guān)，而與分化程度、浸潤程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在這項(xiàng)研究中，Shh、GLI1都和MMP9三者的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，說明Hh信號(hào)傳導(dǎo)通路可能通過上調(diào)MMP9在胃癌中的表達(dá)提高胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Nagai［18］等應(yīng)用Hh信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制劑環(huán)靶明降低MMP9表達(dá)，胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力降低;相反，當(dāng)增強(qiáng)Hh信號(hào)傳導(dǎo)通路活性時(shí)，MMP9的表達(dá)增高而胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力也隨之增強(qiáng)。用小干擾RNA技術(shù)下調(diào)GLI1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，MMP9的表達(dá)受到抑制而胰腺癌的侵襲性下降。用GLI1轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞后，MMP9的表達(dá)上調(diào)同時(shí)胰腺癌的侵襲能力也增強(qiáng)。說明GLI1可通過調(diào)控MMP9的表達(dá)調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。應(yīng)用Cox多因素分析腫瘤部位、切緣狀況、腫瘤大小、腫瘤分化、T分期、TNM分期、周圍神經(jīng)侵犯、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、MMP9陽性表達(dá)、GLI1高表達(dá)與胰腺癌患者的生存時(shí)間的關(guān)系，更進(jìn)一步證明，MMP9陽性表達(dá)和GLI1高表達(dá)可以作為預(yù)測胰腺癌預(yù)后的一項(xiàng)指標(biāo)。

綜上所述，GLI1、MMP9的過表達(dá)在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，過表達(dá)提示預(yù)后不良，對(duì)GI1、MMP9的檢測可有效地評(píng)估胰腺癌患者的預(yù)后并且有望成為胰腺癌治療的新靶點(diǎn)。

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