微載體上MRC-5細胞擴大培養(yǎng)的研究

陳余娟

(四川大學生物治療國家重點實驗室 四川成都 610100)

mrc-5細胞是來源于一個27歲的健康婦女(瑞典)的14周男性胚胎,該細胞核型為46XY,衰老期為48群體倍增代。MRC-5原始種子庫為7代細胞,共481支。2005年該委員會向WHO建議并被批準建立了新的細胞庫,細胞代次為12代。MRC-5細胞株是世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)推薦的可以用于人用疫苗生產(chǎn)的標準人二倍體細胞株,其免疫原性好,具有良好的耐受性,無異種移植致癌性,無外源因子污染,其規(guī)?；囵B(yǎng)適宜生產(chǎn)多種病毒性疫苗。到目前為止,mrc-5細胞被世界各地很多疫苗生產(chǎn)廠家用于疫苗生產(chǎn),比如人二倍體細胞狂犬疫苗(HDCV)。

1 材料

1.1 生物反應器

中國廣州奇志公司生產(chǎn)的BC-15L(工作體積12L)以及BC-100L型(工作體積80L)微載體培養(yǎng)系統(tǒng)。

1.2 細胞

中國成都康華生物制品有限公司MRC-5工作細胞庫細胞,23代。

1.3 微載體

GE公司的cytodex I 型,按照廠家指導進行制備和滅菌處理,使用濃度5g/l-15g/l。

1.4 培養(yǎng)液

日本株式會社的MEM培養(yǎng)液,補加10%的小牛血清(山西太原潤生),0.03%L-谷氨酰胺,1%非必須氨基酸(Gbico)。

1.5 消化液

0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液。

1.6 細胞洗滌液

pH7.2 0.01mol/l PBS溶液

2 方法

2.1 mrc-5細胞的準備

將MRC-5細胞復蘇,并在2000ml K氏瓶中培養(yǎng)擴增,培養(yǎng)條件為pH7.2—7.4、36-37℃、3%-5%CO2、待細胞長成致密單層后,消化、收集細胞懸液。

2.2 微載體培養(yǎng)mrc-5細胞

2.2.1 微載體處理

cytodex I型微載體,按照GE公司說明將微載體用pH7.2 0.01mol/LPBS水化膨脹,高壓滅菌,用培養(yǎng)液置換1-2次后,浸泡2小時以上,備用。

2.2.2 細胞接種

將細胞懸液接種到BC-15L細胞培養(yǎng)罐內(nèi),接種密度(1×105個/ml),培養(yǎng)濃度5g/L。設置好培養(yǎng)參數(shù)(溫度37℃,pH7.2,DO50%,轉(zhuǎn)速40rpm)進行培養(yǎng),每天更換營養(yǎng)液,細胞在微載體上長滿單層后可進行二級放大。

圖2

2.2.3 微載體培養(yǎng)二級放大

種子罐細胞長滿后,用PBS洗滌細胞三次,加入0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液(30ml/g)消化細胞,轉(zhuǎn)速150rpm,消化5、10、15、20分鐘后取樣觀察細胞狀態(tài)并測定細胞活力,細胞從載體上脫離下來后,按比例將細胞懸液轉(zhuǎn)入到BC-100L細胞培養(yǎng)罐擴增,設置好培養(yǎng)參數(shù)進行培養(yǎng)。

2.3 臺盼藍染色法計細胞密度和活力

健康的細胞能夠排斥臺盼藍,而死亡細胞被臺盼藍染成藍色,依據(jù)此原理可通過血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù),來判斷細胞的存活率。

3 結(jié)果

消化cytodex1上的細胞,5min,10min,15min,20min時取樣觀察細胞消化狀態(tài)并拍照,測定細胞活力（圖1）。

加入消化液后,高速攪拌使消化液均勻作用于每個微載體上的細胞,同時也對微載體上的細胞產(chǎn)生剪切力,至細胞損傷,降低細胞的活力,所以選擇一個可接受的消化狀態(tài)對微載體的二級放大是非常重要的,因為如果載體上的細胞未完全脫落時,或是細胞成團狀而未成單個細胞懸液時,又或是細胞消化過度活力降低時都會影響細胞的再次貼壁和培養(yǎng)。

從上圖我們可以發(fā)現(xiàn),當加入消化液5min微載體大多聚集在一起,成團狀,細胞有回縮現(xiàn)象,僅少數(shù)細胞脫離載體,處理10min,載體上80%的細胞已經(jīng)脫落,細胞活力95%,處理15min,細胞95%從微載體上脫落,且形成單個分散的懸液,細胞活力92%,處理20min,細胞完全脫離微載體,此時的細胞活力為85%。因此,選擇0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶消化液作用15min作為mrc-5細胞微載體消化的最佳時間。

4 討論

生物反應器微載體培養(yǎng)過程從實驗室規(guī)模放大到中試甚至于工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的過程中,如何有效的放大一直是生產(chǎn)中的難點(1)。有報道研究是在微載體培養(yǎng)過程中直接將上一級培養(yǎng)物(長滿細胞的微載體)作為種子接入到下一級生物反應器中,通過在舊球和新球的重新分配而實現(xiàn)擴大培養(yǎng)(2),這種培養(yǎng)方法的優(yōu)點在于操作簡單,污染機會小,微載體利用率高,可以連續(xù)使用,但是新舊載體上的細胞處于不同的生長狀態(tài),最終舊載體上長滿細胞而新載體尚未長滿,空球率高,細胞生長沒有明顯的對數(shù)生長期,這反應了細胞群體中細胞的生理狀態(tài)有明顯的差別,細胞代次不一致,不符合于藥品生產(chǎn)的要求。試驗結(jié)果表明使用0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶消化液在BC-15L生物反應器內(nèi)150rpm,消化10-15鐘可獲得活力高且分散均勻的mrc-5細胞懸液。

[1] Kunitake R,Suzuki A,Lchihashi H,et al.Fully-automated roller bottle handling system for large scale culture of mammalian cells(j).J Biotechonology,1997,52(6):289-191.

[2] Wang Y.Quyang F.Bead-to-bead transfer of Vero cells in microcarrier cultrure(J).Cytotechology,1999,31(31):221-224.