金屬硫蛋白2A重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在血管內(nèi)皮細胞中的表達＊

楊 汀，劉海榮，李家麗，劉月明

成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 燒傷整形科（成都 610000）

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是一種存在于細胞中的低分子量、具有金屬結(jié)合特性的蛋白質(zhì)［1］。在哺乳動物體內(nèi)存在4種亞型，包括 MT－1、MT－2、MT－3和 MT－4［2］，具有調(diào)節(jié)金屬離子代謝、清除自由基、抗氧化、抗細胞凋亡以及穩(wěn)定細胞質(zhì)膜和亞細胞器被膜等功能，參與DNA復制、轉(zhuǎn)錄，影響蛋白質(zhì)和能量代謝等［3－6］。Espejo等［7］發(fā)現(xiàn) MT基因敲除小鼠對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的炎癥反應比對應的野生型小鼠更敏感，提示MT在LPS引起的炎癥損傷中可能發(fā)揮保護作用，但具體機制目前尚不清楚。MT－2是MT家族中重要的組成成分，分為MT2A和MT2B兩種亞型，參與細胞增殖、分化和凋亡等過程，并與炎癥、癌癥以及呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關［8－10］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，MT2A與內(nèi)皮高表達脂多糖相關因子1 基 因（endothelial－overexpressed lipopolysaccharide－associated factor 1，EOLA1）存在相互作用，并與LPS損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）過程有關［11］。本研究構(gòu)建 MT2A強制表達載體，并成功轉(zhuǎn)染HUVECs，建立MT2A上調(diào)表達細胞模型，為進一步研究MT2A在內(nèi)皮細胞炎癥損傷中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVECs（美國 ATCC公司）；細胞培養(yǎng)基DMEM（GIBCO 公司）；pEGFP－N1質(zhì)粒由成都醫(yī)學院生物醫(yī)學系實驗中心提供；XhoI、KpnI酶切酶（Themor公司）；cDNA模板（上海英駿生物技術(shù)有限公司）；連接酶（Themor公司）；質(zhì)粒提取試劑盒及PCR產(chǎn)物回收試劑盒（OMEGA公司）；高純總RNA快速提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；Revert AidFirst Strand cDNA Synthesis kit（Thermo公司）；Lipofectamine脂質(zhì)體（Invitrogen公司）；兔抗人（一抗）（Abcam公司）；羊抗兔（二抗）（Invetrogen公 司）；凝 膠 成 像 系 統(tǒng)（BIO－RED 美國）；熒光倒置顯微鏡（Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 pEGFP－N1－MT2A載體構(gòu)建 根據(jù) MT2A ORF序列采用Primer 5.0軟件設計引物。MT2AF：CCTCGAGGATGGATCCCAAC，其 5＇端包含XhoI酶切位點；MT2A－R：GGGTACCCGGCGCA GCAG，其5＇端包含KpnI酶切位點，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。用所設計引物擴增MT2A ORF序列，反應體系共50μL，其中 MT2A－F和MT2A－R各1μL、cDNA模板1μL、master mix 25 μL，加水至50μL。反應條件：94℃3min，94℃10 s，49℃30s，72℃15s循環(huán)35次，72℃5min。將PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，用PCR純化試劑盒將擴增成功的PCR產(chǎn)物的擴增片段全部回收純化。PCR產(chǎn)物和pEGFP－N1載體進行雙酶切，酶切產(chǎn)物瓊脂糖電泳后回收純化，連接酶連接，連接條件：22℃30min，65℃10min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中并培養(yǎng)，37℃過夜，挑取單克隆菌落培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒。對質(zhì)粒進行酶切和測序鑒定。

1.2.2 pEGFP－N1－MT2A 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及觀察 鋪6孔板，每孔約2×106個細胞，待細胞生長到培養(yǎng)板80%時進行轉(zhuǎn)染；取2.5μg pEGFP－N1－MT2A 加入1.5mL EP管中，加入100μL MEM1無血清培養(yǎng)基，此為1號管；另取1.5mL EP管加入100μL MEM1無血清培養(yǎng)基，緩慢加入6μL Lipofectamine脂質(zhì)體，輕輕混勻，此為2號管；將1號管混合物緩慢加入2號管中，室溫靜置20min；用無血清培養(yǎng)基洗HUVECs兩次，加入1mL MEM1無血清，將兩管混合液緩慢加入六孔板中，37℃培養(yǎng)4～5h，后補加20%胎牛血清培養(yǎng)液1 mL繼續(xù)培養(yǎng)48h；將轉(zhuǎn)染細胞放置于激發(fā)波長為488nm的熒光倒置顯微鏡下觀測EGFP在HUVECs中的分布情況。

1.2.3 RT－PCR 檢測 MT2AmRNA 表達水平設立pEGFP－N1－MT2A轉(zhuǎn)染組、pEGFP－N1轉(zhuǎn)染組和空白對照組。收集各組細胞，在無RNA酶條件下提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。據(jù)MT2A基因設計引物，MT2A－F：CACCACGCCTCCTCCAAG；MT2A－R：CGCAGGAGCAGTTGGGATC。反 應體系共50μL，其中SYBR Green 25μL、MT2A－F 1 μL、MT2A－R 1μL、cDNA 2μL、去核酸水21μL。反應條件：95℃10min，95℃15s，62℃20s循環(huán)40次。根據(jù)CT值，計算各組MT2A含量。實驗重復3次。

1.2.4 Western blot檢測 MT2A表達 設立pEGFP－N1－MT2A轉(zhuǎn)染組、pEGFP－N1轉(zhuǎn)染組和空白對照組。收集各組細胞，預冷PBS洗3次，吸盡殘留液，加入適量體積的細胞裂解液，冰上裂解1 h，13 000rpm 4℃ 離心30min，收集上清轉(zhuǎn)移至EP管中，即為細胞總蛋白。BCA法進行蛋白濃度測定：調(diào)整樣品濃度，以每孔80μg蛋白加樣，加入等量體積4×SDS上樣緩沖液，煮沸10min，SDSPAGE膠電泳，電泳分離后的蛋白電轉(zhuǎn)至0.22μm PVDF膜上，用脫脂牛奶封閉，加一抗4℃孵育過夜，TBST洗6次，每次5min，加二抗37℃孵育1 h，TBST洗5次，每次10min，用ECL發(fā)光法測定蛋白表達情況。實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 MT2A的ORF擴增

PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)在略小于200bp處（目的蛋白大小為186bp）有一清晰條帶，說明MT2A的ORF擴增成功（圖1）。

圖1 MT2A的ORF擴增（M：DNA Mark；1：MT2A基因ORF）

2.2 重組質(zhì)粒的酶切與測序鑒定

pEGFP－N1－MT2A重組載體經(jīng)過XhoI和Kpn I雙酶切后，電泳可見大小為4 700bp、186bp的DNA條帶，與理論值一致，初步驗證pEGFP－N1－MT2A構(gòu)建成功（圖2）。經(jīng)酶切驗證的重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒中MT2AORF序列與Genebank中的序列一致（圖3）。

圖2 重組質(zhì)粒pEGFP－N1－MT2A的酶切分析（M：DL5000mark；1：重組質(zhì)粒pEGFP－N1－MT2AORF）

圖3 MT2A基因測序結(jié)果

2.3 pEGFP－N1－MT2A在HUVECs中的轉(zhuǎn)染情況

轉(zhuǎn)染48h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞，可見綠色熒光表達，72h到達高峰，細胞計數(shù)計算轉(zhuǎn)染效率約為70%（圖4）。

圖4 pEGFP－N1－MT2A轉(zhuǎn)染HUVECs細胞

2.4 MT2AmRNA表達水平

pEGFP－N1－MT2A轉(zhuǎn)染組、pEGFP－N1轉(zhuǎn)染組和空白對照組3組細胞RT－PCR檢測顯示：pEGFP－N1－MT2A轉(zhuǎn)染組條帶明顯高于pEGFPN1轉(zhuǎn)染組和空白對照組（圖5）。經(jīng)熒光定量PCR儀附帶軟件分析，pEGFP－N1－MT2A 轉(zhuǎn)染組2－△△Ct值為1.267±0.064，方差分析結(jié)果顯示其2－△△Ct值明顯高于pEGFP－N1轉(zhuǎn)染組和空白對照組（P＜0.05）（表1）。

圖5 MT2AmRNA表達水平

表1 3組細胞MT2AmRNA表達水平

2.5 MT2A蛋白表達情況

pEGFP－N1－MT2A轉(zhuǎn)染組、pEGFP－N1轉(zhuǎn)染組和空白對照組3組細胞Western blot檢測顯示：pEGFP－N1－MT2A轉(zhuǎn)染組條帶明顯高于pEGFPN1轉(zhuǎn)染組和空白對照組（圖6），經(jīng)Qualityone圖像處理軟件定量分析，pEGFP－N1－MT2A轉(zhuǎn)染組灰度值為（1.728±0.064），方差分析結(jié)果顯示，其灰度值明顯高于pEGFP－N1轉(zhuǎn)染組和空白對照組（P＜0.05）（表2）。

圖6 MT2A蛋白表達水平

表2 3組細胞的灰度值

3 討論

嚴重燒創(chuàng)傷患者由于外源性細菌感染或腸源性細菌和內(nèi)毒素移位，易誘發(fā)膿毒癥（sepsis），引起全身性炎癥反應綜合癥（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），臨床上預防和治療十分棘手，目前為止仍是大面積燒傷、嚴重創(chuàng)傷最主要的死亡原因［12］。目前已證實LPS是膿毒癥的主要啟動子，LPS激活內(nèi)皮細胞是一復雜的病理生理過程，包括特異受體的感知、刺激信號的內(nèi)傳、胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導以及相關基因的表達和細胞表型的改變。由于LPS在炎癥反應發(fā)生發(fā)展過程中起主導作用，近幾十年來有大量研究試圖通過加入外源性物質(zhì)對抗LPS，從而控制炎癥反應，研究方向主要集中在中和、拮抗和競爭性抑制LPS，但在治療膿毒癥方面未取得令人滿意的效果［13］。因此，研究機體對LPS刺激產(chǎn)生的內(nèi)源性保護反應及其機制顯得越發(fā)重要。

MT是機體重要的自我保護性蛋白，其中MT2A在清除氧自由基、抑制炎癥反應等方面有重要作用，我們前期研究結(jié)果也證實MT2A可減輕內(nèi)皮 細 胞 LPS 損 傷［11］。Eckschlager 等［14］指 出MT2A的過度表達是多種腫瘤對放療、化療產(chǎn)生耐藥性的重要原因，這反映了MT2A在抵抗細胞損傷方面的強大作用。為進一步研究MT2A在內(nèi)皮細胞炎癥反應中的作用，必須建立可調(diào)控MT2A表達的細胞模型。本實驗通過擴增MT2A的ORF片段，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pEGFP－N1－MT2A，重組質(zhì)粒通過測序驗證。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HUVECs中，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細胞呈綠色，證實轉(zhuǎn)染成功。用 RT－PCR 和 Western blot實 驗 檢 測HUVECs中MT2AmRNA和MT2A蛋白的表達水平，結(jié)果顯示，pEGFP－N1－MT2A組高于空白對照組及pEGFP－N1組，證明可通過重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方式成功構(gòu)建MT2A上調(diào)表達細胞模型。本研究為進一步探索MT2A在炎癥中的作用機制奠定了基礎。

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