低溫脅迫下外源水楊酸對栝樓幼苗抗寒性影響*

劉 鵬， 曹 林， 王利華， 劉 丹， 徐根娣， 馬 麗， 酈 楓

(浙江師范大學(xué)生態(tài)研究所，浙江金華 321004)

低溫脅迫下外源水楊酸對栝樓幼苗抗寒性影響*

劉 鵬， 曹 林， 王利華， 劉 丹， 徐根娣， 馬 麗， 酈 楓

(浙江師范大學(xué)生態(tài)研究所，浙江金華 321004)

以耐寒性較強(qiáng)的三門峽栝樓和耐寒性較弱的安慶栝樓為實驗材料，研究了低溫(4℃)脅迫下噴施不同濃度(0，0.25，0.5，1和2 mmol/L)的水楊酸溶液對栝樓幼苗葉片生理生長特性及抗氧化酶活性的影響.實驗結(jié)果表明:在低溫處理下，2個品種栝樓幼苗的細(xì)胞膜透性、游離脯氨酸(Pro)含量和可溶性蛋白含量均增加(P＜0.05)，而相對水含量出現(xiàn)了相反的變化趨勢，植株超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、酯酶(EST)和細(xì)胞色素氧化酶(CYT)的活性呈現(xiàn)增加的現(xiàn)象，顯示出2個栝樓品種的耐寒性差異;噴施低濃度的水楊酸溶液能夠顯著降低植株的相對電導(dǎo)率、質(zhì)膜透性及Pro和可溶性蛋白的含量，而高濃度的水楊酸對于降低植株SOD，POD，PPO，EST和CYT的活性均沒有低濃度的顯著.由此可知，適宜濃度的水楊酸有緩解栝樓低溫脅迫的效果，但不能消除冷脅迫對栝樓生長的抑制作用.外源水楊酸緩解栝樓低溫脅迫的最適濃度是0.5 mmol/L.

水楊酸;栝樓;低溫脅迫;抗寒性

栝樓(Trichosanthes kirilowii Maxim)是一種多年生的攀緣草本植物，也稱瓜萎、吊瓜，屬葫蘆科.近年來對于栝樓的研究主要側(cè)重于種質(zhì)資源［1］、親緣關(guān)系［2］、繁殖［3］及耐鋁性［4－5］等方面，而對栝樓抗寒性的研究較少.水楊酸(Salicylic acid)是一種簡單的酚類化合物，廣泛存在于植物體內(nèi)，在植物抗逆生理中具有重要的作用，為植物對逆境反應(yīng)的信號傳導(dǎo)分子，能夠誘導(dǎo)相關(guān)蛋白基因表達(dá)，引發(fā)系統(tǒng)獲得性抗性.水楊酸已被證明能夠調(diào)節(jié)植物許多抗逆生理過程，如抗病性、抗鹽性、抗寒性和抗旱性等［6］.目前，栝樓產(chǎn)業(yè)已在我國開始蓬勃發(fā)展，已經(jīng)在生產(chǎn)中創(chuàng)造了很大的經(jīng)濟(jì)效益，但也面臨一些問題，尤其是面對冬季晝夜溫差較大、氣候異變等冷凍害帶來的經(jīng)濟(jì)損失.近年來國內(nèi)外在作物寒害方面做了許多的研究工作，但有關(guān)水楊酸對栝樓抗寒性的系統(tǒng)研究在國內(nèi)外至今還少見報道.本實驗以耐寒性不同的三門峽栝樓和安慶栝樓為材料，研究了在低溫脅迫下不同濃度的水楊酸處理時膜脂的過氧化水平和體內(nèi)酶保護(hù)系統(tǒng)的變化規(guī)律，探討了水楊酸與栝樓幼苗抵抗低溫的關(guān)系，為栝樓耐低溫的營養(yǎng)機(jī)理提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料及處理

以耐寒性較強(qiáng)的三門峽栝樓和耐寒性較弱的安慶栝樓為實驗材料.選取顆粒飽滿、大小一致的三門峽栝樓和安慶栝樓的種子，破殼后播種于盛有沙土的盆中，待苗長至10 cm左右時選取長勢一致的幼苗，移到完全營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，3 d換一次營養(yǎng)液，營養(yǎng)液參照文獻(xiàn)［7］配制，待幼苗長至10～12片真葉時進(jìn)行處理.

將實驗材料進(jìn)行分組，每組3次重復(fù).對照(CK)組為 25℃正常生長植株;T0組，噴施0 mmol/L水楊酸溶液;T1組，噴施0.25 mmol/L水楊酸溶液;T2組，噴施0.5 mmol/L水楊酸溶液;T3組，噴施1 mmol/L水楊酸溶液;T4組，噴施2 mmol/L水楊酸溶液.各組在低溫脅迫前24 h噴施水楊酸一次，24 h后再噴施一次，然后4℃低溫處理，5 d后采樣測定指標(biāo)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

1.2 生理指標(biāo)測定

葉片相對含水量參考文獻(xiàn)［8］的方法測定.細(xì)胞膜透性的測定參照文獻(xiàn)［9］的方法.抗氧化物質(zhì)的測定:游離脯氨酸采用茚三酮法［10］;可溶性蛋白質(zhì)含量利用考馬斯亮藍(lán)法［11］;超氧化物岐化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性的測定分別采用NBT光化還原法［12］和愈創(chuàng)木酚法［13］;多酚氧化酶(PPO)、酯酶(EST)和細(xì)胞色素氧化酶(CYT)的活性測定分別參照文獻(xiàn)［14］、［15］和［16］的方法.

利用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評估，具體公式為:

式(1)、式(2)表示i處理水平下j指標(biāo)的抗脅迫隸屬函數(shù)值，其中:xij表示i處理水平下j指標(biāo)的測定值;xjmax和xjmin分別為該處理水平下所測指標(biāo)的最大值和最小值.在計算各生理指標(biāo)脅迫系數(shù)的隸屬函數(shù)值時，如果耐脅迫系數(shù)與脅迫呈正相關(guān)，則用式(1)計算;如果耐脅迫系數(shù)與脅迫呈負(fù)相關(guān)，則用式(2)計算.式(3)表示在i水平下抗脅迫隸屬函數(shù)的平均值.

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)為3次獨立試驗所得.所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，分析差異顯著性;Origin 8.0軟件制圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 外源水楊酸對低溫脅迫下栝樓生理特性的影響

2.1.1 對葉片相對含水量的影響

葉片相對含水量表示植株在遭受逆境脅迫后植株葉片的含水量，可以直接反映出植株葉片細(xì)胞的水分生理狀態(tài)［17］.如圖1所示:在低溫脅迫下，T0組較對照組葉片含水量，三門峽栝樓下降25.7%，安慶栝樓下降31.8%，可見，低溫逆境脅迫下三門峽栝樓葉片的保水能力大于安慶栝樓;噴施水楊酸后，2種栝樓葉片的相對含水量均有所升高.由此說明，噴施水楊酸可以減少低溫脅迫對植株水分的虧損.安慶栝樓葉片相對含水量下降的程度高于三門峽栝樓，說明三門峽栝樓葉片能保持較高的含水量.因此，三門峽栝樓維持生命活動正常進(jìn)行的能力大于安慶栝樓.

圖1 外源水楊酸對低溫脅迫下栝樓葉片相對水含量的影響

2.1.2 對細(xì)胞膜透性的影響

脅迫逆境下，植株細(xì)胞受到損傷的重要特征之一是細(xì)胞膜透性增加［18］.從圖2中看出:低溫脅迫下，三門峽栝樓和安慶栝樓的細(xì)胞膜透性均增加，安慶栝樓各處理組的細(xì)胞膜透性均高于三門峽栝樓;2種栝樓的T0組均較對照組升高，三門峽栝樓升高44.3%，安慶栝樓升高44.1%;噴施水楊酸后，2種栝樓的細(xì)胞膜透性均下降，且T1和T2組下降幅度最大，但安慶栝樓T4組的細(xì)胞膜透性值高于其他各組.可見，2 mmol/L的水楊酸不能降低安慶栝樓的細(xì)胞膜透性，相反地增加了栝樓受傷害的程度.由此可見，噴施適宜濃度的水楊酸可以顯著降低低溫對栝樓細(xì)胞膜的傷害，從而發(fā)揮抗冷的作用.

圖2 外源水楊酸對低溫脅迫下栝樓細(xì)胞膜透性的影響

2.1.3 對游離脯氨酸含量的影響

低溫脅迫下，細(xì)胞通過積累大量的相容性物質(zhì)使細(xì)胞的滲透壓升高，保水能力加強(qiáng)，冰點降低，從而增強(qiáng)植株的抗冷性［19］.如圖3所示:低溫處理5 d后，2種栝樓不同處理組的脯氨酸含量均增加，三門峽栝樓和安慶栝樓的T0組較對照組分別增加58.5%和200.9%;噴施水楊酸后，葉片脯氨酸含量顯著高于對照組，但低于T0組.由此可見，低溫脅迫可以提高栝樓葉片脯氨酸含量，這可能是植物對低溫條件的一種適應(yīng)，噴施水楊酸則降低脯氨酸在植株體內(nèi)的積累，減少低溫脅迫的傷害作用.

圖3 外源水楊酸對低溫脅迫下栝樓脯氨酸含量的影響

2.1.4 對可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

可溶性蛋白質(zhì)含量參與維持植物細(xì)胞穩(wěn)定的滲透勢水平，可溶性蛋白質(zhì)的含量越高，細(xì)胞的保水能力、保護(hù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和整體性的能力越強(qiáng)，同時還可以延緩細(xì)胞的衰老，最終起到抵御脅迫帶來傷害的作用［17］.近年來的研究表明，可溶性蛋白質(zhì)含量的高低是植株抵抗逆境能力大小的一個重要因素.馮曉英等［20］的研究表明，植物處于逆境脅迫時，蛋白質(zhì)的合成速率及其含量都會有所下降.

低溫脅迫下，水楊酸處理對不同耐寒性栝樓葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的影響如圖4所示.三門峽栝樓，T1組可溶性蛋白質(zhì)含量較對照組增加，且有顯著性差異;其他水楊酸處理組(T1～T4組)可溶性蛋白質(zhì)含量均較T0組下降，但均高于對照組.安慶栝樓，T1組可溶性蛋白質(zhì)含量較對照組增加，但無顯著性差異;而其他水楊酸處理組可溶性蛋白質(zhì)含量均低于T0組和對照組，T2～T4組與T0組有顯著性差異.噴施水楊酸后，三門峽栝樓和安慶栝樓的可溶性蛋白含量的變化不一樣，可能是由于品種的差異性導(dǎo)致植株對逆境的生理反應(yīng)不同.

圖4 外源水楊酸對低溫脅迫下栝樓可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

2.2 外源水楊酸對低溫脅迫下栝樓抗氧化酶活性的影響

2.2.1 SOD，POD和PPO的活性

三門峽栝樓和安慶栝樓POD活性變化趨勢(見圖6)一致.低溫脅迫顯著增加了2種栝樓的POD活性.由此說明，植物在受到低溫逆境的脅迫時通過增加POD活性來提高抗寒性是一個重要的途徑.而不同濃度水楊酸的加入降低了2種栝樓的POD活性.

PPO為多酚氧化酶，被認(rèn)為是植物抵抗不良環(huán)境脅迫的物質(zhì)之一，提高植株P(guān)PO的活性可以增強(qiáng)植株的抗逆性.如圖7所示:低溫脅迫5 d后，2種栝樓PPO活性均增加，且T0組較對照組分別增加了67.9%(三門峽栝樓)和43.4%(安慶栝樓);噴施水楊酸組，三門峽栝樓的PPO活性低于T0組但高于對照組，安慶栝樓的PPO活性除T1組外其余均高于對照組和T0組.安慶栝樓PPO活性整體上均低于三門峽栝樓各處理組.

圖5 外源水楊酸對低溫脅迫下栝樓SOD活性的影響

圖6 外源水楊酸對低溫脅迫下栝樓POD活性的影響

圖7 外源水楊酸對低溫脅迫下栝樓PPO活性的影響

2.2.2 CYT和EST的活性

細(xì)胞色素氧化酶(CYT)是細(xì)胞色素代謝途徑中的關(guān)鍵酶，其活性的高低直接影響細(xì)胞色素途徑所占的比例［21］，影響植株的總呼吸強(qiáng)度，進(jìn)一步影響植株生理代謝的強(qiáng)度和抵抗逆境的能力.如圖8所示:低溫脅迫下，水楊酸處理后，三門峽栝樓和安慶栝樓CYT活性均增加;三門峽栝樓T0組較對照組CYT活性升高39.4%且有顯著性差異，噴施水楊酸組CYT活性較T0組略有下降但仍高于對照組，且T1～T3組與對照組和T0組均呈顯著性差異;安慶栝樓T0組較對照組CYT活性升高39.85%，噴施水楊酸后CYT活性較T0組升高，其中T1組較對照組和T0組分別增加了119.5%和57.0%.

圖8 外源水楊酸對低溫脅迫下栝樓CYT活性的影響

從圖9可以看出:T0組較對照組EST活性升高，安慶栝樓EST活性升高幅度高于三門峽栝樓;三門峽栝樓T1和T2組EST活性明顯高于其他處理組，T3和T4組EST活性大小與對照和T0組相似，無顯著性差異;安慶栝樓水楊酸處理后EST活性較對照組降低，無顯著差異，但與T0組有顯著性差異.

圖9 外源水楊酸對低溫脅迫下栝樓EST活性的影響

2.3 隸屬函數(shù)均值耐寒性分析

采用模糊隸屬函數(shù)方法對實驗中所測的9個生理指標(biāo)進(jìn)行了計算分析，綜合評價了不同濃度水楊酸處理緩解低溫傷害的能力.如表1所示，不同濃度水楊酸對2個品種栝樓緩解低溫脅迫的作用大小均為0.5 mmol/L＞0.25 mmol/L＞1 mmol/L＞0 mmol/L＞2 mmol/L.由此可知，0.5 mmol/L水楊酸處理對提高栝樓抗寒性的效果最好.

表1 2個品種栝樓耐寒隸屬函數(shù)指標(biāo)及評價

3 討論

細(xì)胞膜是植物細(xì)胞與外界環(huán)境的屏障，細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性與植物抵抗逆境密切相關(guān).逆境條件下，細(xì)胞膜受到破壞，細(xì)胞膜蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，電解質(zhì)向細(xì)胞外滲透，導(dǎo)致電導(dǎo)率增加.電導(dǎo)率可衡量細(xì)胞膜的損傷程度，電導(dǎo)率的值越大，細(xì)胞質(zhì)膜透性越大，質(zhì)膜受損傷程度就越嚴(yán)重［22］.細(xì)胞膜透性增加是植株受到低溫傷害的一個重要標(biāo)志［23］.本實驗中，0.25～0.5 mmol/L水楊酸處理顯著降低了低溫脅迫下栝樓幼苗葉片的相對電導(dǎo)率和質(zhì)膜透性.這可能是由于水楊酸通過誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜上的信號傳遞途徑，傳導(dǎo)低溫逆境信號，使植物產(chǎn)生抗寒的能力.

植物對低溫逆境的反應(yīng)是一個非常復(fù)雜的生理過程.本研究結(jié)果表明，低溫脅迫下，未噴施水楊酸組栝樓葉片的相對含水量下降，細(xì)胞膜透性、可溶性蛋白質(zhì)含量、脯氨酸含量及各種保護(hù)酶活性升高，而噴施不同濃度的水楊酸后，各生理指標(biāo)的變化不同.許多研究表明，滲透調(diào)節(jié)作用的變化是植物對逆境響應(yīng)的重要生理機(jī)制［24］.當(dāng)植物受到逆境脅迫后，植物細(xì)胞通過增加細(xì)胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來增加細(xì)胞內(nèi)的溶質(zhì)濃度，從而降低滲透勢，使細(xì)胞保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，維持植株的正常生命活動，脯氨酸是有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì).也有報道表明，可溶性蛋白質(zhì)的含量與植物抵抗逆境的作用大小呈正相關(guān)［25］.安慶栝樓水楊酸處理后可溶性蛋白質(zhì)含量低于對照組和T0組.因此筆者認(rèn)為，水楊酸通過誘導(dǎo)脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量的變化趨勢可能不同，但最終都是為了提高栝樓的抗寒性.

近年來，“自由基傷害學(xué)說”在植物抗逆境機(jī)理的研究中一直相當(dāng)活躍.植物在正常生長情況下產(chǎn)生的羥自由基(·OH)、超氧自由基()和過氧化氫(H2O2)等活性氧物質(zhì)能夠很快地被植物體內(nèi)的SOD和POD等保護(hù)酶清除.SOD將歧化為H2O2，而POD又可以清除·OH和H2O2等物質(zhì)，使活性氧類物質(zhì)的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，不會對植物產(chǎn)生“毒害”作用［26－27］.PPO廣泛存在于植株的各個組織、器官中，存在于植物體內(nèi)各種應(yīng)激反應(yīng)酶系，參與植株的抗逆性生理調(diào)節(jié)［28］.本實驗結(jié)果表明:在低溫脅迫下，栝樓的SOD，POD，PPO，EST和CYT的活性均上升，說明低溫脅迫對栝樓的生理產(chǎn)生一定的作用;而噴施水楊酸后，SOD，POD和PPO等酶的活性低于未噴施水楊酸組(T0組)，可能是水楊酸誘發(fā)植株產(chǎn)生一系列的生理反應(yīng)，減輕了栝樓受低溫的傷害.

總之，筆者認(rèn)為，低溫脅迫使栝樓細(xì)胞膜脂化程度加劇，增強(qiáng)了栝樓酶類和非酶類物質(zhì)的生理代謝;而噴施適宜濃度的水楊酸，增強(qiáng)了栝樓的自我保護(hù)能力，表現(xiàn)為植株傷害得到緩解.此外，本研究還表明，低溫脅迫下2種栝樓的膜脂過氧化水平和體內(nèi)保護(hù)系統(tǒng)對低溫脅迫的反應(yīng)存在一定的基因型差異，安慶栝樓總體上膜脂過氧化程度較高，體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)總體能力低于三門峽栝樓，表明三門峽栝樓在抵抗低溫脅迫方面具有優(yōu)越性.通過隸屬函數(shù)平均值可知，在本實驗噴施0.5 mmol/L水楊酸可明顯增強(qiáng)栝樓對低溫脅迫的抵抗能力.

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(責(zé)任編輯 薛 榮)

Effect of salicylic acid on cold tolerance of Trichosanthes kirilowii Maxim seedling under low temperature stress

LIU Peng， CAO Lin， WANG Lihua， LIU Dan， XU Gendi， MA Li， LI Feng

(Institute of Ecology，Zhejiang Normal University，Jinhua Zhejiang 321004，China)

Two kinds of Trichosanthes kirilowii Maxim，one was sanmenxia Trichosanthes kirilowii with strong cold resistance and the other one was Anqing Trichosanthes kirilowii with weak cold resistance，were taken as the experiment materials，to analyze the effect of physical growth characteristics and autioxidant enzyme activities in spraying salicylic acid with different concentrations(0，0.25，0.5，1，2 mmol/L)for Trichosanthes kirilowii seedling leaves under the low temperature(4℃)stress.The experimental results showed that for Trichosanthes kirilowii seedling treatment under low temperature，the cell membrane permeability and free proline(Pro)and soluble protein contents of two kinds of Trichosanthes kirilowii increase(P＜0.05)，while the relative water content(RWC)appeared the opposite tendency，and the plant superoxide dismutase(SOD)，peroxidase(POD)，polyphenol oxidase(PPO)，esterase(EST)and cytochrome oxidase(CYT)increased，showing the cold resistance difference between two kinds of Trichosanthes kirilowii，Spaying SA in appropriatelow concentration significantly reduced the relative conductivity，plasma membrane permeability and Pro and soluble protein contents，but spaying SA in high concentration did not affect reducing the contents of SOD，POD，PPO，EST and CYT of plants.The SA in appropriate concentration had the effect of alleviating the Trichosanthes kirilowii under the low temperature stress，but did not eliminate the inhibition of cold stress on Trichosanthes kirilowii growth.The optimal concentration of exogenous salicylic acid to alleviate Trichosanthes kirilowii was 0.5 mmol/L.

salicylic acid(SA);Trichosanthes kirilowii Maxim;low temperature stress;cold tolerance

S567.9;Q945.78

A

1001－5051(2015)01－0009－06

?:2014－11－03;

2014－11－13

浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項目(2011C22053)

劉 鵬(1965－)，男，湖南冷水江人，教授，博士.研究方向:植物生理生態(tài);植物逆境生理;環(huán)境污染與保護(hù).

10.16218/j.issn.1001－5051.2015.01.002