p38信號(hào)通路參與P19CL6細(xì)胞早期心肌分化*

黃巧麗， 李 濤， 姜科聲， 劉羿男， 李賢慧， 劉元偉

(1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004;2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物學(xué)系，北京100191;3.武警后勤學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，天津 300162;4.浙江醫(yī)院心內(nèi)科，浙江杭州 310013)

p38信號(hào)通路參與P19CL6細(xì)胞早期心肌分化
*

黃巧麗1， 李 濤1， 姜科聲1， 劉羿男2， 李賢慧3， 劉元偉4

(1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004;2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物學(xué)系，北京100191;3.武警后勤學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，天津 300162;4.浙江醫(yī)院心內(nèi)科，浙江杭州 310013)

以P19CL6小鼠畸胎瘤細(xì)胞心肌分化為模型，研究了p38信號(hào)通路在干細(xì)胞心肌分化早期階段的作用.在誘導(dǎo)劑二甲基亞砜作用下，P19CL6細(xì)胞分化為自發(fā)跳動(dòng)的心肌細(xì)胞，表達(dá)心肌標(biāo)志性基因.在誘導(dǎo)分化過程中，p38信號(hào)通路活化.采用特異性抑制劑SB203580在早期分化階段封閉p38信號(hào)通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn):高劑量SB203580誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;低劑量SB203580抑制心肌祖細(xì)胞標(biāo)志基因GATA4和Nkx2.5的表達(dá)，并顯著下調(diào)生心性信號(hào)分子BMP2和BMP4的表達(dá).而過表達(dá)p38 α質(zhì)粒則能促進(jìn)P19CL6細(xì)胞表達(dá)GATA4和Nkx2.5.表明p38信號(hào)通路正性調(diào)控P19CL6細(xì)胞的早期心肌分化，并維持細(xì)胞的增殖和存活能力.

P19CL6細(xì)胞;心肌分化;p38激酶;信號(hào)通路

干細(xì)胞向心肌分化的過程中，首先分化為中胚層細(xì)胞，繼而分化為心肌前體干細(xì)胞，最終發(fā)育為自發(fā)搏動(dòng)的功能性心肌細(xì)胞.在心肌多步驟程序分化過程中，涉及到多個(gè)信號(hào)通路的時(shí)空啟閉，包括骨形成蛋白(BMP)、Wnt和Notch等信號(hào)通路.已證實(shí)Wnt和Notch信號(hào)促進(jìn)心肌早期分化，但抑制晚期分化.這表明信號(hào)通路的時(shí)空啟閉關(guān)乎干細(xì)胞在分化道路上的命運(yùn)選擇［1］.目前干細(xì)胞研究中一大熱點(diǎn)是:利用小分子化合物對(duì)特異的信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)制，從而引發(fā)定向分化或增強(qiáng)誘導(dǎo)分化效率［2］.

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，在介導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用.MAPK通路大致分為p38，ERK，JNK和ERK5四個(gè)亞家族，通過對(duì)不同底物蛋白的磷酸化修飾，將胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，引發(fā)細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，廣泛參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)事件［3］.

本文對(duì)p38信號(hào)通路在P19CL6細(xì)胞早期心肌分化中的作用進(jìn)行了初步研究.P19CL6細(xì)胞是Habara－Onkubo等將小鼠P19畸胎瘤細(xì)胞經(jīng)過多次傳代建立的一個(gè)亞細(xì)胞系，分化潛能主要表現(xiàn)為中胚層方向定向分化.與P19細(xì)胞需要懸浮誘導(dǎo)不同的是，P19CL6細(xì)胞在貼壁條件下經(jīng)二甲基亞砜(DMSO)誘導(dǎo)，可以簡(jiǎn)便高效地獲得分化的心肌細(xì)胞.P16CL6細(xì)胞已經(jīng)成為比較公認(rèn)的研究干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的細(xì)胞模型.采用經(jīng)典的二甲基亞砜誘導(dǎo)P16CL6細(xì)胞8～12 d，分化效率可達(dá)到70%～90%.

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

P19CL6小鼠畸胎瘤干細(xì)胞為北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部周春燕教授惠贈(zèng).pcDNA3－HA－p38 α質(zhì)粒由以色列大學(xué)Engelberg教授饋贈(zèng);pEGFP－N1質(zhì)粒為Clontech公司產(chǎn)品.Lipofectamine 2000購(gòu)自 Invitrogen公司，總RNA提取試劑(RNAVzol)及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京威格拉斯公司，Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京寶賽公司;MMLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自 Promega公司;Taq DNA聚合酶購(gòu)自New England Biolabs公司;Hoechst33342購(gòu)自Sigma公司.SB203580和BCA法蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天公司，抗α－actinin抗體購(gòu)自Sigma公司，抗p－p38和總p38抗體購(gòu)自Cell Signaling公司，抗GAPDH抗體、辣根過氧化酶及FITC標(biāo)記的二抗均購(gòu)自北京中杉金橋公司.PCR引物由北京奧科公司合成.

1.2 P19CL6細(xì)胞的培養(yǎng)及貼壁誘導(dǎo)分化

液氮凍存的P19CL6細(xì)胞解凍后常規(guī)培養(yǎng)傳代，培養(yǎng)于:α－MEM培養(yǎng)基 +10%胎牛血清(FBS)+100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素(雙抗).將P19CL6細(xì)胞進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)，按3.7×105細(xì)胞密度用含1%二甲基亞砜(細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))的誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種于直徑60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi).待細(xì)胞貼壁后，每隔2 d換液1次.誘導(dǎo)當(dāng)天記為0 d.貼壁誘導(dǎo)6 d后撤除二甲基亞砜，繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液.

1.3 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)活力

將P19CL6細(xì)胞以1.8×104/孔接種至96孔板上，1%二甲基亞砜誘導(dǎo)，同時(shí)加入不同劑量的SB203580(0，5，10，20 μmol/L).37℃孵育48 h后終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液.每孔加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解.在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度(A490nm).按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率:

每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用配對(duì)t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

1.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR及實(shí)時(shí)PCR

RNA提取方法參照產(chǎn)品說明.在1×106細(xì)胞中加入1 mL總 RNA提取試劑，冰上放置5 min，使細(xì)胞裂解;加入0.2 mL氯仿，振蕩混勻，冰上靜置2 min，使核蛋白解離;4℃12 000 r/min離心15 min;取上清，加入0.5 mL異丙醇，顛倒混勻，冰上靜置10 min;4℃ 12 000 r/min離心10 min;棄上清，在RNA沉淀中加入1 mL 75%乙醇溶液混勻;4℃7 500 r/min離心10 min;棄上清，充分晾干，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液溶解，測(cè)定其濃度及純度.取5 μg總RNA經(jīng)MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為PCR的模板.將5 μg總RNA與2 μL隨機(jī)引物溶液(0.5 μg/μL)混合，加DEPC水溶液補(bǔ)足至終體積12.5 μL.70℃水浴變性5 min，置冰上2 min.每管中再加入以下試劑:4 μL反應(yīng)緩沖液，2 μL脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)溶液(10 mmol/L)，0.5 μL RNA酶抑制劑溶液(40 U/μL)，1 μL MMLV溶液(200 U/μL).加DEPC水溶液補(bǔ)足至20 μL后混勻，輕離心，37℃反應(yīng)1 h.70℃滅活5 min，離心1 min，－80℃保存?zhèn)溆?

PCR引物及擴(kuò)增條件為:18s基因正向引物5'－GTAACCCGTTGAACCCCAATT－3'，反向引物5'－CCATCCAATCGGTAGTAGCG－3，擴(kuò)增條件為58℃退火，共25個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物大小151 bp;GATA4基因正向引物5'－CTCGATATGTTTGATGACTTCT－3'，反向引物5'－CGTTTTCTGGTTTGAATCCC－3'，擴(kuò)增條件為60℃退火，共40個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物大小為400 bp;α－MHC基因正向引物 5'－ACCGTGGACTACAACAT－3'，反向引物5'－CTTTCGCTCGTTGGGA－3'，擴(kuò)增條件為60℃退火，共35個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物大小為287 bp.

實(shí)時(shí)PCR采用TOYOBO公司的SYBR Green Real－time PCR Master Mix在ABI7700型定量PCR儀上進(jìn)行.反應(yīng)體系為:7.5 μL 2×SYBR Green Master Mix緩沖液，0.25 μL正向引物溶液(10 pmol/μL)，0.25 μL反向引物溶液(10 pmol/μL)，1 μL cDNA模板溶液，滅菌去離子水補(bǔ)足至15 μL.PCR反應(yīng)條件:95℃變性10 min，95℃15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán).測(cè)定樣品的Ct(Cycle threshold，循環(huán)閾值)，通過計(jì)算2－△△Ct來比較不同樣品之間特定基因的表達(dá)差異.結(jié)果來自2次平行實(shí)驗(yàn)各3次重復(fù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式在柱狀圖中顯示.PCR引物見表1.

表1 引物序列信息

1.5 免疫熒光鑒定

用細(xì)胞刮輕輕刮取跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)，離心，棄上清;將沉淀加入到含有OCT包埋劑的Eppendorf管內(nèi)，然后浸入液氮中速凍15 s;置冰凍切片機(jī)上切片，切片厚度要求為7 μm，60℃烘干.4%多聚甲醛溶液于室溫固定切片15 min;0.5%的Triton X－100/磷酸鹽緩沖液(磷酸鹽吐溫緩沖液)膜打孔10 min;2%牛血清白蛋白(BSA)溶液37℃孵育30 min，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn);2%BSA溶液稀釋的抗α－actinin抗體(1∶200稀釋)，4℃孵育過夜;磷酸鹽吐溫緩沖液漂洗3遍后加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的熒光二抗，濕盒內(nèi)避光孵育30 min;磷酸鹽吐溫緩沖液充分漂洗后，1 μg/mL Hoechst33342核復(fù)染色5 min，漂洗后，緩沖甘油封片(V(磷酸鹽緩沖液)∶V(甘油)= 1∶9)，置熒光顯微鏡(Fluoview300，Olympus)下觀察.

1.6 蛋白印跡

用冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液將細(xì)胞洗2遍，將細(xì)胞刮下收集到Eppendorf管中，5 000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞，加入預(yù)冷的裂解緩沖液(50 mmol/L Tris－HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)，1%壬基酚聚氧乙烯醚(NP－40)，0.5%脫氧膽酸鈉)，將細(xì)胞重懸，冰上孵育30 min后，12 000 r/min離心15 min，上清即為全細(xì)胞裂解液.BCA法進(jìn)行蛋白定量.30 μg蛋白煮沸后，10%SDS－PAGE電泳轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗雜交，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗孵育后化學(xué)發(fā)光法顯色.

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

P19CL6細(xì)胞經(jīng)胰酶消化收集:每樣本細(xì)胞數(shù)為1×106，1 000 r/min離心3 min棄去培養(yǎng)液.用結(jié)合緩沖液洗滌1次，1 000 r/min離心5 min.用100 μL的Annexin V－FITC標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育15 min，1 000 r/min離心5 min，沉淀細(xì)胞用孵育緩沖液洗1次.上機(jī)前5 min碘化丙啶(PI)染色.流式細(xì)胞儀分析:流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)用488和515 nm的通帶濾器檢測(cè)FITC熒光，大于560 nm的濾器檢測(cè)PI.

1.8 質(zhì)粒提取及轉(zhuǎn)染

質(zhì)粒大量提取方法見威格拉斯公司產(chǎn)品說明書.轉(zhuǎn)染的前一天，消化細(xì)胞、計(jì)數(shù).以4×105/孔細(xì)胞濃度接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)開始轉(zhuǎn)染.每孔細(xì)胞需2 μg純化質(zhì)粒，用50 μL無血清、無雙抗的培養(yǎng)基稀釋.每孔細(xì)胞需要4 μL Lipofectamin2000，用50 μL無血清、無雙抗的培養(yǎng)基稀釋，混勻后室溫靜置5 min.分別將質(zhì)粒與脂質(zhì)體充分混勻，室溫靜置20 min，將混合物加入6孔板，輕搖使其均勻分布在孔板內(nèi).將細(xì)胞放置于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng).6 h后將培養(yǎng)基更換為含1%二甲基亞砜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析.P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有非常顯著性差異.

2 結(jié)果

2.1 P19CL6細(xì)胞心肌誘導(dǎo)分化模型的建立

如圖1(a)所示，常規(guī)培養(yǎng)的P19CL6細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈不規(guī)則長(zhǎng)梭形，立體感強(qiáng)，邊緣光滑，具有折光性.用1%二甲基亞砜對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，細(xì)胞匯合后以集落的方式生長(zhǎng)，在單層的細(xì)胞上可見許多個(gè)復(fù)層生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)，類似胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中形成的“擬胚體樣”結(jié)構(gòu)，即發(fā)生三胚層分化，經(jīng)外胚層和內(nèi)胚層釋放的信號(hào)分子誘導(dǎo)中胚層細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞.誘導(dǎo)后的8 d，在細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)的區(qū)域開始零星出現(xiàn)跳動(dòng)的細(xì)胞群.隨著誘導(dǎo)分化繼續(xù)進(jìn)行，自發(fā)節(jié)律性跳動(dòng)的細(xì)胞團(tuán)數(shù)目逐步增加，搏動(dòng)區(qū)域連接成片，一般于誘導(dǎo)12 d達(dá)到高峰，最高有80%的細(xì)胞團(tuán)產(chǎn)生跳動(dòng).

將未誘導(dǎo)的P19CL6細(xì)胞及誘導(dǎo)12 d的細(xì)胞冰凍切片，分別進(jìn)行心肌細(xì)胞特異的α－輔肌動(dòng)蛋白(α－actinin)免疫熒光染色.如圖1(b)所示，未誘導(dǎo)的P19CL6檢測(cè)不到心肌細(xì)胞α－輔肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，而誘導(dǎo)12 d的P19CL6大部分細(xì)胞都表達(dá)α－輔肌動(dòng)蛋白，表明P19CL6細(xì)胞被成功誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞.

圖1 P19CL6細(xì)胞的心肌分化

2.2 p38激酶在心肌誘導(dǎo)分化過程中活化時(shí)相的變化

心肌細(xì)胞的分化是一個(gè)按照既定分子程序進(jìn)行的過程，但在分化過程中根據(jù)特異性基因的表達(dá)，可以劃分出幾個(gè)關(guān)鍵性的分化階段.干細(xì)胞向心肌分化的啟動(dòng)階段為中胚層分化，其后分化為生心性中胚層，細(xì)胞分化為心肌定向祖細(xì)胞，標(biāo)志為心肌特異轉(zhuǎn)錄因子GATA4，Nkx2.5的表達(dá);然后由心肌特異轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)心肌結(jié)構(gòu)基因、功能性基因表達(dá)，如α肌球蛋白重鏈(α－MHC);其后已分化的心肌細(xì)胞逐步成熟，最終表現(xiàn)出自發(fā)性節(jié)律性搏動(dòng).通過RT－PCR檢測(cè)P19CL6細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中分化標(biāo)志基因的表達(dá)，可以發(fā)現(xiàn):未分化的P19CL6細(xì)胞不表達(dá)GATA4和α－MHC;分化4 d可檢測(cè)到GATA4表達(dá);分化8 d方可檢測(cè)到α－MHC表達(dá)(見圖2(a)).據(jù)此，可將P19CL6細(xì)胞心肌分化大致劃分為早期(1～4 d)、中期(4～8 d)和晚期(8～12 d)3個(gè)階段，其中早期階段主要的細(xì)胞分子事件為干細(xì)胞分化為心肌祖細(xì)胞，表達(dá)GATA4等標(biāo)志基因.

為了解p38通路是否參與心肌程序分化，提取各分化階段的P19CL6細(xì)胞蛋白進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，通過檢測(cè)活化形式的磷酸化p38來了解p38通路在心肌分化過程中是否活化.如圖2(b)所示，p38蛋白磷酸化水平隨分化過程逐步增強(qiáng)，提示p38通路參與心肌程序分化.

2.3 SB203580對(duì)細(xì)胞存活和凋亡的影響

為了解p38通路是否參與心肌程序分化，使用特異性抑制劑SB203580封閉p38激酶活性，檢測(cè)抑制 p38通路對(duì)心肌分化的影響.首先在P19CL6細(xì)胞分化培養(yǎng)基中加入不同劑量的SB203580，培養(yǎng)2 d后經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)活力.結(jié)果顯示，高劑量(20 μmol/L)SB203580極大地抑制了細(xì)胞活力，而較低劑量(1，5 μmol/L) SB203580對(duì)細(xì)胞活力影響較小(見圖3(a)).進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，20 μmol/L SB203580誘導(dǎo)2 d，導(dǎo)致細(xì)胞大量脫落漂浮(見圖3(b)).通過Annexin V－PI雙染流式分析發(fā)現(xiàn)，20 μmol/L SB203580誘導(dǎo)P19CL6細(xì)胞凋亡(見圖3(c)).統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，SB203580組(79.7±5.0)%的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而對(duì)照二甲基亞砜誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡率為(5.6±2.7)%(見圖3(d)).這些結(jié)果表明，p38信號(hào)通路參與了P19CL6細(xì)胞早期分化階段，起維持細(xì)胞正?；钚约霸鲋车淖饔茫钄鄍38信號(hào)通路可誘發(fā)細(xì)胞凋亡.

圖2 P19CL6分化期間p38級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活

圖3 高濃度SB203580誘導(dǎo)早期分化階段P19CL6細(xì)胞凋亡

2.4 SB203580對(duì)P19CL6細(xì)胞早期分化的抑制

低劑量SB203580對(duì)P19CL6細(xì)胞無明顯的毒性，基本不影響細(xì)胞增殖，不誘發(fā)凋亡.P19CL6細(xì)胞誘導(dǎo)分化1～4 d中持續(xù)加入1或5 μmol/L SB203580，4 d末提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L SB203580抑制GATA4，Nkx2.5的表達(dá)(見圖4(a)和(b)).表明抑制p38信號(hào)通路導(dǎo)致心肌早期分化效率明顯降低，降低了心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，抑制了心肌祖細(xì)胞的產(chǎn)生，提示p38信號(hào)通路正性調(diào)控早期心肌分化.

為進(jìn)一步探究p38信號(hào)通路調(diào)控早期心肌分化的機(jī)制，通過實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)心肌分化關(guān)鍵信號(hào)分子BMP2和BMP4的表達(dá).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P19CL6細(xì)胞心肌分化過程中BMP2和BMP4的表達(dá)明顯增高，但5 μmol/L SB203580處理顯著抑制了二者的表達(dá)(見圖4(b)和(c)).本結(jié)果提示，p38信號(hào)通路誘導(dǎo)生心性信號(hào)分子的表達(dá)，正性調(diào)控早期心肌分化.

圖4 低濃度SB203580抑制P19CL6細(xì)胞早期分化

圖5 p38α過表達(dá)促進(jìn)P19CL6細(xì)胞早期分化

2.5 過表達(dá)p38信號(hào)對(duì)P19CL6細(xì)胞早期分化的促進(jìn)

為進(jìn)一步明確p38信號(hào)通路對(duì)早期心肌分化的調(diào)控，進(jìn)行了p38α質(zhì)粒過表達(dá)實(shí)驗(yàn).如圖5(a)所示，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)組P19CL6細(xì)胞獲得了p38蛋白的高表達(dá).EGFP或p38α質(zhì)粒過表達(dá)的P19CL6細(xì)胞，再按常規(guī)程序經(jīng)1%二甲基亞砜誘導(dǎo)4 d后提取RNA，通過實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)早期心肌分化標(biāo)志基因的表達(dá).結(jié)果如圖5(b)和(c)所示，p38α蛋白過表達(dá)組的GATA4和Nkx2.5基因表達(dá)明顯增高，其中GATA4基因表達(dá)增高了(3.0±0.3)倍，Nkx2.5基因表達(dá)增高了(1.7±0.3)倍.因此，本實(shí)驗(yàn)證明p38信號(hào)通路正性調(diào)控早期心肌分化.

3 討論

干細(xì)胞具有全能性、無限增殖和多向分化的潛能，能分化為包括心肌在內(nèi)的多種細(xì)胞，為缺血性心臟病的徹底治愈提供了希望.如何提高干細(xì)胞向心肌分化的效率是目前的研究熱點(diǎn)［1－2］.利用小分子化合物在特定發(fā)育階段，特別是分化早期對(duì)特異的信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，是改善誘導(dǎo)分化效率的重要發(fā)展方向.

干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化有一定的程序過程.經(jīng)歷了從多潛能干細(xì)胞向前體心肌祖細(xì)胞分化，最終發(fā)育為終末分化成熟心肌細(xì)胞的程序化過程，涉及細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因調(diào)控過程.已發(fā)現(xiàn)多個(gè)信號(hào)分子在心肌分化的調(diào)控中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，包括BMP，Wnt，Notch和FGF等，對(duì)心肌分化的影響呈現(xiàn)階段特異性特征.這啟迪了研究者根據(jù)心肌分化的特定時(shí)間段改變誘導(dǎo)劑組分，以一種“多階段性”的方式誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌分化［1－2］.多個(gè)研究報(bào)告顯示，BMP2，BMP4及同家族的Activin A蛋白均可誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌分化，但使用BMP信號(hào)通路的抑制劑dorsomorphin亦能大幅促進(jìn)心肌分化，關(guān)鍵在于dorsomorphin加藥階段只能限于起始分化最早的24 h［4］.由于Wnt信號(hào)促進(jìn)心肌早期分化，但抑制晚期分化，在干細(xì)胞早期分化階段添加 Wnt信號(hào)激動(dòng)劑CHIR99021，或在細(xì)胞發(fā)育為中胚層細(xì)胞后添加Wnt信號(hào)抑制劑KY02111，均可促進(jìn)干細(xì)胞向心肌的分化［5－6］.

調(diào)制MAPK通路可以影響心肌分化.MAPK信號(hào)通路家族是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與細(xì)胞增殖分化關(guān)系密切，其家族成員中ERK激酶通路通常介導(dǎo)生長(zhǎng)因子信號(hào)，而p38和JNK激酶通路通常介導(dǎo)應(yīng)激性信號(hào)，包括各種理化刺激、炎癥及細(xì)胞因子刺激，ERK4激酶通路通常參與增殖及壓力應(yīng)激信號(hào)的傳導(dǎo)［3］.在胚胎干細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，p38信號(hào)通路在心肌早期分化階段發(fā)揮著重要作用.p38信號(hào)通路的開啟與否決定了干細(xì)胞的早期分化命運(yùn).p38激酶活化的細(xì)胞選擇中胚層分化道路，最終分化為心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、平滑肌等中胚層來源的組織細(xì)胞;而p38激酶活性抑制的細(xì)胞選擇發(fā)育為外胚層細(xì)胞，最終分化為神經(jīng)細(xì)胞.因此，p38信號(hào)通路可以發(fā)揮“開關(guān)”的作用，調(diào)控干細(xì)胞的分化方向，可能與調(diào)控p53蛋白的穩(wěn)定性相關(guān)［7－10］，但具體機(jī)制尚不清楚.此外，p38通路也參與了晚期心肌分化.在異丙腎上腺素、血管緊張素誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞晚期心肌分化中，抑制p38激酶會(huì)降低自發(fā)搏動(dòng)的擬胚體數(shù)目，抑制心肌標(biāo)志基因的表達(dá)［11－12］.

本實(shí)驗(yàn)通過抑制劑及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，在P19CL6畸胎瘤干細(xì)胞中驗(yàn)證了p38信號(hào)通路對(duì)于早期心肌分化的關(guān)鍵作用.本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的p38激酶抑制劑SB203580處理阻斷了早期分化的P19CL6細(xì)胞增殖，大量誘導(dǎo)凋亡，提示p38信號(hào)通路維持了早期分化階段干細(xì)胞的增殖和存活能力.盡管文獻(xiàn)中經(jīng)常使用20 μmol/L劑量的SB203580封閉p38通路，同時(shí)并不干擾細(xì)胞的存活，但在本實(shí)驗(yàn)中卻出現(xiàn)了大量的細(xì)胞凋亡，推測(cè)原因?yàn)樵谥睆?0 mm的皿中P19CL6細(xì)胞誘導(dǎo)分化的鋪板密度為3.7×105細(xì)胞，細(xì)胞密度極低，因此無法耐受高劑量的SB203580.適度劑量的SB203580則干擾心肌早期分化，導(dǎo)致定向心肌祖細(xì)胞標(biāo)志基因GATA4，Nkx2.5顯著下調(diào).同時(shí)，SB203580抑制了生心性關(guān)鍵信號(hào)分子BMP2和BMP4的表達(dá).由于BMP信號(hào)對(duì)GATA4和Nkx2.5基因的表達(dá)有重要的誘導(dǎo)作用，因此封閉p38通路可以阻斷心肌分化的進(jìn)程.p38表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)同樣證明了 p38通路可以誘導(dǎo) GATA4和Nkx2.5的表達(dá)，從而促進(jìn)早期心肌分化.總的來說，本實(shí)驗(yàn)顯示，p38信號(hào)通路在P19CL6細(xì)胞心肌分化的早期階段發(fā)揮了重要作用，主要體現(xiàn)在維持細(xì)胞增殖和存活能力，驅(qū)動(dòng)向定向心肌祖細(xì)胞的分化.

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示，早期活化p38通路具有提高心肌分化效能的潛力.但不可忽視的是，亦有文獻(xiàn)報(bào)道心肌分化早期抑制p38通路能夠微弱地促進(jìn)心肌分化［13－14］，顯示了p38通路在細(xì)胞分化中的復(fù)雜作用.例如，在BMP2誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞心肌分化過程中，加入SB203580反而能促進(jìn)心肌標(biāo)志物的表達(dá)［15］.干細(xì)胞誘導(dǎo)分化受到細(xì)胞系、血清、誘導(dǎo)劑種類、劑量等多種因素的影響.本實(shí)驗(yàn)采用P19CL6畸胎瘤細(xì)胞系，并采用貼壁誘導(dǎo)，與文獻(xiàn)［13－14］報(bào)道的用胚胎干細(xì)胞擬胚體培養(yǎng)、END2條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)存在一定的差異.因此，本實(shí)驗(yàn)通過SB203580抑制p38通路，未發(fā)現(xiàn)明顯的促心肌分化效應(yīng).總之，由于p38通路在干細(xì)胞分化中的重要作用，對(duì)其具體的作用及機(jī)制仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究.

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(責(zé)任編輯 薛 榮)

The effect of p38 cascade in the early differentiation of P19CL6 cells towards cardiomyocytes

HUANG Qiaoli1， LI Tao1， JIANG Kesheng1， LIU Yinan2， LI Xianhui3， LIU Yuanwei4

(1.College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua Zhejiang 321004，China;2.Department of Cell Biology，Health Sciences Center，Peking University，Beijing 100191，China;3.Department of Biochemistry and Molecular Biology，Logistics University of CAPF，Tianjin 300162，China;4.Department of Cardiology，Zhejiang Hospital，Hangzhou Zhejiang 310013，China)

It was estimated the effect of p38 cascade in the early stage of cardiac differentiation using P19CL6 mouse pluripotent carcinoma stem cells.In the presence of DMSO，P19CL6 cells were successfully induced to differentiate into spontaneously contracting cardiomyocytes characterized by the expression of cardiac－specific genes.It was observed the activation of p38 cascade during the differentiation process.Treatment with a high concentration of SB203580，a specific inhibitor of p38 kinase，significantly induced apoptosis of P19CL6 cells.Meanwhile，SB203580 at a low concentration greatly hampered the expression of cardiac marker genes GATA4 and Nkx2.5，and decreased the expression of cardiac differentiation－promoting factors such as BMP2 and BMP4.Additionally，overexpression of p38 α plasmids facilitated the expression of GATA4 and Nkx2.5.Taken these together，these results indicated that p38 cascade exerted a positive effect on the early differentia－tion of P19CL6 cells，and played an important role in maintaining cell growth and survival.

P19CL6 cells;cardiac differentiation;p38 kinase;signaling pathway

Q254

A

1001－5051(2015)01－0095－08

?:2014－03－11;

2014－06－27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31101057;31470082);浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LY14C120001)

黃巧麗(1990－)，女，浙江嵊州人，碩士研究生.研究方向:分子發(fā)育生物學(xué).

李 濤.E－mail:litao@zjnu.cn

10.16218/j.issn.1001－5051.2015.01.016