臨床酵母樣真菌的系統(tǒng)鑒定及耐藥性研究

王洪曼 孫銘艷 王保強(qiáng) 陶元勇*

[文章編號] 1672-8270(2015)03-0067-04 [中圖分類號] R446.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A

臨床酵母樣真菌的系統(tǒng)鑒定及耐藥性研究

王洪曼①孫銘艷②王保強(qiáng)②陶元勇②*

[文章編號] 1672-8270(2015)03-0067-04 [中圖分類號] R446.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A

目的：通過對酵母樣真菌的系統(tǒng)鑒定，分析醫(yī)院酵母樣真菌感染情況及耐藥現(xiàn)狀，以指導(dǎo)臨床合理用藥，為減少真菌感染提供試驗(yàn)依據(jù)。方法：將各種臨床標(biāo)本分離培養(yǎng)后使用法國VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀、酵母菌鑒定卡及ATB Fungus 3藥敏板進(jìn)行真菌鑒定和藥敏試驗(yàn)。結(jié)果：共檢出院內(nèi)酵母樣真菌感染210例，以假絲酵母菌為主(占97.14%)，其中白色假絲酵母菌140株(占66.67%)，熱帶假絲酵母菌30株(占14.29%)。對伊曲康唑的敏感率最低僅為53.3%，對氟康唑、伏立康唑、卡泊芬凈、5-氟胞嘧啶和米卡芬凈的耐藥率均＜7%，兩性霉素B耐藥率為0%。結(jié)論：假絲酵母菌是院內(nèi)感染最常見的酵母樣真菌，耐藥性有增長趨勢，故應(yīng)加強(qiáng)真菌的分離、鑒定以及耐藥性監(jiān)測，以指導(dǎo)臨床合理選擇藥物。

酵母樣真菌；系統(tǒng)鑒定；耐藥性；阿薩希毛孢子菌

DOI∶ 10.3969/J.ISSN.1672-8270.2015.03.022

[First-author’s address] Department of Laboratory Medicine, Weifang Medicine University, Weifang 261053, China.

真菌在自然界分布極為廣泛，且種類繁多，并寄生于人體皮膚和黏膜，屬于條件致病菌。近年來，由于廣譜抗生素、抗腫瘤藥物、激素和免疫抑制劑在臨床的廣泛應(yīng)用，器官移植及導(dǎo)管技術(shù)的開展以及艾滋病和糖尿病發(fā)病率的不斷上升，真菌感染的發(fā)病率呈上升趨勢[1]。目前，臨床上可用于抗真菌的藥物有限，而耐藥率也逐漸升高，并且出現(xiàn)二重感染。因此，加強(qiáng)真菌感染的控制及藥物監(jiān)測，有效防治真菌二重感染及提高治愈率已成為目前臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)重要課題。本研究收集臨床標(biāo)本中分離到的真菌210株，對其臨床分布及耐藥情況進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院于2013年1-12月住院的患有慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、支氣管擴(kuò)張及肺癌等肺部基礎(chǔ)病以及尿路感染、真菌性陰道炎及骨髓炎等患者標(biāo)本和門診送檢的各類標(biāo)本。入選患者1680例，其中男性875例，女性805例；年齡1～90歲，從中分離出酵母樣真菌210菌株，剔除相同部位的重復(fù)菌株。

1.2 設(shè)備與材料

(1)儀器與試劑。采用法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀、Bact/ ALERT 3D 120全自動(dòng)血培養(yǎng)儀；使用哥倫比亞血瓊脂平板、沙保弱培養(yǎng)基、VITEK 2酵母菌鑒定卡YBC；酵母樣真菌藥敏試劑盒(微量稀釋法)ATB Fungus 3為法國梅里埃Biomerieux公司產(chǎn)品；卡泊芬凈、米卡芬凈等微量肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn)檢測板條由山東鑫科生物科技股份有限公司提供。

(2)培養(yǎng)基。使用改良SHADOMY瓊脂，適用于所有的抗真菌藥，主要成分包括酵母氮瓊脂基礎(chǔ)，葡萄糖和天冬氨酸，通過磷酸緩沖液控制二重感染，pH值為7.0。同時(shí)添加氯霉素控制細(xì)菌的污染。

(3)標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)量控制。本研究所用白色念珠菌ATCC90028、近平滑念珠菌ATCC22019和克柔念珠菌ATCC6258均由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.3 方法

(1)分離培養(yǎng)與鑒定。血液、腹水等無菌體液標(biāo)本操作接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，經(jīng)Bact/ALERT 3D 120全自動(dòng)血培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)，陽性報(bào)警后涂片觀察并轉(zhuǎn)接種于沙保弱培養(yǎng)基上。痰液、尿液及分泌物等直接接種于沙保羅培養(yǎng)基、血平板上，放入35℃孵育箱培養(yǎng)18～24 h，通過菌落觀察和涂片進(jìn)行初步鑒定。挑取培養(yǎng)基上單個(gè)酵母樣菌落，采用VITEK-2全自動(dòng)微生物鑒定儀和酵母菌鑒定卡YBC對真菌種類作出鑒定。

(2)藥敏。利用酵母樣真菌藥敏試劑盒(微量稀釋法)ATB Fungus 3酵母樣真菌藥敏板條對210株菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏結(jié)果可通過肉眼判讀，或者應(yīng)用ATB儀器判讀獲取MIC，按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)標(biāo)準(zhǔn)和ATB Fungus 3產(chǎn)品說明書的建議將菌株分為敏感、中介或耐藥。

(3)數(shù)據(jù)處理與分析。藥敏試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用WHONET 5.6專業(yè)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床標(biāo)本來源及分布

酵母樣真菌感染患者的年齡分布在1～90歲，其中男性60例(占57.1%)，女性45例(占42.9%)；60歲以上的老年患者61例(占58.1%)。所分離出的210株酵母樣真菌分布在臨床各類標(biāo)本中，其中主要來自痰液(占27.62%)、尿液(占16.19%)、咽拭子(占12.36%)、分泌物(占12.36%)和膿液(占10.48%)等標(biāo)本，分離鑒定的210株酵母樣真菌以白假絲酵母菌為主，共140株(占66.67%)；其次是熱帶假絲酵母菌30株(占14.29%)；近平滑假絲酵母菌18株(占8.57%)，見表1。

2.2 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

對210株酵母樣真菌進(jìn)行氟康唑、兩性霉素B、伏立康唑、卡泊芬凈、5-氟胞嘧啶、伊曲康唑及米卡芬凈共7種藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)所有真菌對兩性霉素B(100%)、米卡芬凈(99.0%)、卡泊芬凈(98.1%)、5-氟胞嘧啶(97.1%)敏感性最強(qiáng)，其次為伏立康唑(93.3%)、氟康唑(90.5%)，對伊曲康唑耐藥性最強(qiáng)，耐藥率為32.4%，見表2。

表1 210株酵母樣真菌分類及在不同標(biāo)本中的分布(株)

表2 酵母樣真菌對抗真菌藥物的耐藥率[%(株)]

3 討論

近年來，隨著超廣譜抗生素、腎上腺皮質(zhì)激素和免疫制劑等應(yīng)用的增多，介入性治療手段的不斷開展，臨床真菌感染不斷上升，耐藥性也越來越強(qiáng)[2]。本研究顯示，在酵母樣真菌感染患者中， 標(biāo)本類型主要是痰和尿液，分別占27.62%、16.19%，年齡＞60歲的患者占到58.1%，提示老年人呼吸系統(tǒng)易受到真菌的侵襲，其屬于特殊的易感人群，患有COPD、支氣管擴(kuò)張及肺癌等肺部基礎(chǔ)病，而且長期臥床免疫力低下，抵抗力差，長期聯(lián)合應(yīng)用廣譜抗菌藥物引起菌群失調(diào)、誘發(fā)真菌感染[3]。

在檢出的2 1 0株真菌中，白假絲酵母菌占66.67%，與李文波等[3]的報(bào)道結(jié)果相近，表明白假絲酵母菌在真菌感染中仍占主要地位，其原因是白假絲酵母菌的菌絲對人體的皮膚和黏膜等部位具有較強(qiáng)的粘附力，形成速度快，不易被吞噬，增強(qiáng)了白色念珠菌的致病性，而且白假絲酵母菌較容易形成生物膜，膜內(nèi)的固著細(xì)胞較浮游細(xì)胞不易受抗真菌藥的影響而耐藥性增加[4-5]。本研究中菌株數(shù)量位于2、3位的是熱帶假絲酵母菌(14.29%)和近平滑假絲酵母菌(8.57%)。此外，還檢出了數(shù)種少見的酵母樣真菌，如羅倫隱球菌5例、阿薩希毛孢子菌1例、都柏林假絲酵母菌1例等。羅倫隱球菌屬非致病性腐生菌，只是在機(jī)體免疫功能受損，抵抗力下降時(shí)致病，通常起病隱襲進(jìn)展緩慢檢出困難，臨床少見[6]。但在本研究中，羅倫隱球菌檢出率為2.38%，對伊曲康唑的耐藥率達(dá)到60.0%，應(yīng)引起臨床注意。

阿薩希毛孢子菌(Trichosporon asahii，T. asahii)是一種條件致病菌，廣泛存在于自然界中，國內(nèi)首次分離鑒定見于楊蓉婭等[7]的研究報(bào)道，并與2012年5月完成標(biāo)準(zhǔn)株(CBS 2479)與環(huán)境株(CBS 8904)全基因組測序[8]。國外報(bào)道多發(fā)生于免疫功能低下如惡性腫瘤、惡性血液病、器官移植及HIV感染晚期的患者等，可引起系統(tǒng)性和致命性的感染[9-10]。近年來，在免疫正常人群也有該菌播散性感染的報(bào)道[11]。本研究分離的阿薩希毛孢子菌對卡泊芬凈、米卡芬凈等棘白菌素類藥物和5-氟胞嘧啶耐藥，對唑類藥物和兩性霉素B敏感與郭朝霞等[12]研究的體外藥物敏感試驗(yàn)一致，可作為經(jīng)驗(yàn)用藥的參考，其耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究顯示，210株酵母樣真菌對7種抗真菌藥物存在不同程度耐藥，其中兩性霉素B的敏感率為100.0%，其原因可能在于兩性霉素B毒性大，臨床應(yīng)用較少。對卡泊芬凈、米卡芬凈的敏感率極高，耐藥率＜2.0%，該類抗真菌藥物是一類半合成環(huán)脂肽類物質(zhì)，能非競爭性的抑制β-1，3-D-葡聚糖合成酶而阻止真菌細(xì)胞壁合成[13]。由于人體細(xì)胞無細(xì)胞壁、沒有β-1，3-D-葡聚糖合成酶這個(gè)作用靶點(diǎn)，此類藥物對人體細(xì)胞影響不大且安全性高。對氟康唑和伏立康唑的敏感度較高，其耐藥率均＜7.0%。伊曲康唑敏感性最低，僅為53.3%，其脂溶性高，是臨床上常用的藥物，但其服用后視覺障礙及皮膚反應(yīng)較為常見，故不宜長時(shí)間服用，伊曲康唑的高耐藥率與臨床長期濫用抗真菌藥物有關(guān)，故氟康唑、卡泊芬凈可作為真菌治療的經(jīng)驗(yàn)用藥[14]。

臨床上出現(xiàn)真菌合并感染的情況不多見，一般都為單一真菌感染，在本研究中出現(xiàn)4例合并感染。據(jù)賀密會(huì)等[15]報(bào)道，合并感染的病死率較單一感染的高，故比單純感染危險(xiǎn)性大，提示在發(fā)生真菌合并感染時(shí)，更要加強(qiáng)警惕，積極治療，以避免死亡的發(fā)生。

綜上所述，臨床微生物室應(yīng)對送檢標(biāo)本提高真菌的檢驗(yàn)手段，準(zhǔn)確地分離、鑒定，加強(qiáng)真菌的耐藥監(jiān)測，供臨床醫(yī)師合理選擇抗真菌藥物。臨床醫(yī)師也要提高對真菌感染的認(rèn)識(shí)，對有使用廣譜抗菌藥物、老年患者及ICU患者等免疫功能低下患者，要特別注意預(yù)防和監(jiān)測，盡可能避免真菌引起的二重感染，以期達(dá)到正確治療和有效控制真菌感染的目的。

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Research on systematic identification and drug-resistant analysis of yeast-like fungus in clinic

WANG Hong-man, SUN Ming-yan, WANG Bao-qiang, et al// China Medical Equipment,2015,12(3)∶67-70.

Objective∶ Through the system identification of yeast-like fungus, analyze hospital infection and drug-resistant to guide clinical therapy, in order to reduce fungal infections provide the experimental basis. Methods∶ After the isolation and culture of various clinical specimens, tests of fungi identification and drug sensitive were performed by using VITEK 2 Compact Automated microbial identification system, Yeast identification card, ATB Fungus 3 fungal produced by the France BioMerieux company. Results∶ In 210 strains, yeast-like fungal infections were isolated, with Candida, accounting for 97.14%, of which a maximum of Candida albicans, 66.67%, followed by Candida tropical 14.29%. Sputum was detected fungi most, accounting for 27.62%, mainly in elderly patients. The Sensitive rate of itraconazole was lowest, only 53.3%, fluconazole, voriconazole, caspofungin, 5-fluorocytosine and micafungin resistance rates all lower than 7%, amphotericin B resistance rate was 0. Conclusion∶ Candida was the most common infection yeast-like fungi, there were increasing trend of drug resistance. It should strengthen the separation of fungus, identification and monitoring of drug resistance to guide clinical rational drug of choice.

Yeast-like fungus; Systematic identification; Drug-resistace; Trichosporon asahii

王洪曼,女,(1986- ),碩士研究生。濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)系，研究方向：細(xì)菌及真菌分類鑒定與耐藥性。

2014-05-13

①濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)系 山東 濰坊 261053

②濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 山東 濰坊 261031

*通訊作者：taoyuanyong@163.com