固態(tài)發(fā)酵法降解油茶粕中單寧的研究

刁歡，湯強(qiáng)，廖應(yīng)升 （安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥230088）

油茶是我國南方地區(qū)的一種木本油料作物，油茶粕是油茶經(jīng)榨油后的殘?jiān)?，是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的工業(yè)副產(chǎn)品。油茶粕營養(yǎng)成分豐富，主要有粗蛋白（10%～15%），粗脂肪（5%），糖類（30%～40%）、粗纖維（15%～20%）和水分（14%），以及對動物生長發(fā)育有利的必需微量元素 Mg、Fe、Ca、Mn、Zn、Cu［1］。因此，油茶粕是一種優(yōu)良的天然植物蛋白資源，可作為優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料源。然而，由于油茶粕中含有茶皂素、單寧等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而限制了其在飼料中的應(yīng)用。

單寧（Tannin）又稱單寧酸（Tannic acid）、鞣質(zhì)，是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚類化合物的統(tǒng)稱，其相對分子質(zhì)量一般為500～3000。由于單寧味苦澀影響飼料的適口性，從而降低了動物攝食率［2］。過量的單寧還可降低蛋白質(zhì)、氨基酸的消化率，并損傷腸壁，進(jìn)而影響動物的生長發(fā)育［3］；再者，單寧可與消化道黏膜蛋白結(jié)合，形成不溶性復(fù)合物排出體外，增加了內(nèi)源氮的排泄量。研究表明，單寧酶可水解沒食子單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸和葡萄糖，且單寧酶屬于誘導(dǎo)酶，主要利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)獲得［4，5］。因此，通過微生物發(fā)酵的方法產(chǎn)生單寧酶，促進(jìn)單寧的有效生物降解，是生產(chǎn)中將油茶粕轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料源的關(guān)鍵。本研究擬采用發(fā)酵過程中可產(chǎn)生單寧酶、發(fā)酵能力強(qiáng)的黑曲霉和酵母菌作為菌種［6，7］，從溫度、pH、發(fā)酵時(shí)間等因素出發(fā)，研究微生物固態(tài)發(fā)酵中單寧酶產(chǎn)生和單寧降解的最佳條件，并將單寧含量調(diào)控到對動物體有益的范圍［8］，以期為油茶粕作為蛋白質(zhì)飼料源使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 菌種

黑曲霉、酵母菌購于中國工業(yè)菌種保藏中心。

1.1.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

油茶粕培養(yǎng)基：油茶粕13g、可溶性淀粉1g、尿素1.5g、磷酸氫二鈉0.05g、七水硫酸鎂0.015g、牛肉膏0.2g、七水硫酸亞鐵0.03g、酵母膏0.5g、蒸餾水100mL，自然pH，121℃滅菌20min。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15～20g、自來水1000mL，自然pH，121℃滅菌20min。

1.1.3 種子液的培養(yǎng)

酵母種子液的培養(yǎng)：將酵母菌從斜面培養(yǎng)基接種至裝有50mL麥芽汁液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃、160r／min培養(yǎng)24h。

霉菌種子液的培養(yǎng)：將霉菌從斜面培養(yǎng)基接種至裝有50mLPDA液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃、160r／min培養(yǎng)24h。

混菌按照接菌比例1∶1。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

DA－180M型顯微鏡、AL204型電子天平、PHS－3C精密酸度計(jì)、HH－S型水浴鍋、Lac－5060S滅菌鍋、Lab－Tech SPX智能型培養(yǎng)箱、HZQ－QG型振蕩器、721型分光光度計(jì)。

1.2 發(fā)酵條件優(yōu)化方法

1.2.1 發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

取培養(yǎng)基中的菌液，以10%的接種量接種于油茶粕培養(yǎng)基中，在恒溫30℃、pH 5的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別在發(fā)酵1、2、3、4、5、6d后取樣測定單寧的含量。設(shè)置未接菌種的油茶粕培養(yǎng)基作為對照組，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 pH的優(yōu)化

取培養(yǎng)基中的菌液，以10%的接種量接種于油茶粕培養(yǎng)基中，恒溫30℃下，分別在pH為3、4、5、6、7、8條件下發(fā)酵3d后取樣測定單寧含量，設(shè)置未接菌種的油茶粕培養(yǎng)基作為對照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

取培養(yǎng)基中的菌液，以10%的接種量接種于油茶粕培養(yǎng)基中，自然pH（pH 6.6～7.0）下，分別在10、15、20、25、30℃和35℃下發(fā)酵3d后取樣測定單寧含量，設(shè)置未接菌種的油茶粕培養(yǎng)基（發(fā)酵溫度30℃）作為對照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.3 單寧的測定

單寧含量的測定方法采用分光光度法，參照林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《單寧酸分析試驗(yàn)方法》（LY／T 1642－2005）［9］進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時(shí)間對不同菌種發(fā)酵的油茶粕中單寧含量的影響

隨著發(fā)酵時(shí)間從1d逐漸增加到6d，不同菌種對油茶粕中單寧的分解能力呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，其中混菌發(fā)酵油茶粕單寧含量在3d時(shí)降低到最小值0.52%（占油茶粕總量的比例），但隨著發(fā)酵時(shí)間延長至4～6d后，3個(gè)處理之間無顯著差異（P＞0.05）（表1）。

2.2 不同發(fā)酵pH對不同菌種發(fā)酵的油茶粕單寧含量的影響

隨著pH從3上升到8，不同菌種對油茶粕中單寧的分解能力呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，其中混菌發(fā)酵油茶粕單寧含量在pH為5時(shí)降低到最小值，且顯著低于對照組和其他試驗(yàn)組（P＜0.05），此時(shí)單寧含量為0.51%（表2）。

2.3 不同發(fā)酵溫度對不同菌種發(fā)酵的油茶粕單寧含量的影響

隨著發(fā)酵溫度從15℃上升到35℃，油茶粕中單寧的分解能力呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。混菌發(fā)酵油茶粕的單寧含量在28℃時(shí)降低到最小值0.48%，顯著低于對照組和其他處理組（P＜0.05）（表3）。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間下不同菌種發(fā)酵后的油茶粕中單寧的含量

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同發(fā)酵條件下，微生物發(fā)酵能夠有效降解油茶粕中單寧，且對單寧的降解能力呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，其中黑曲霉和酵母菌的混菌試驗(yàn)組在發(fā)酵時(shí)間3d時(shí)，油茶粕中單寧含量降低至0.46%，顯著高于其他試驗(yàn)組和對照組。

發(fā)酵時(shí)間為4d以上時(shí)，各處理組之間單寧含量沒有顯著差異。綜合各菌種在不同時(shí)間段對油茶粕中單寧的降解結(jié)果，以混菌發(fā)酵效果最好，更符合實(shí)際生產(chǎn)要求。考慮到發(fā)酵時(shí)間延長會帶來的生產(chǎn)成本的增加，以及油茶粕中單寧含量的升高，較適宜的發(fā)酵時(shí)間為3d。

溫度和pH對發(fā)酵結(jié)果的主要影響是其對微生物的生長和相應(yīng)酶活性的影響［10］。研究表明，真菌和植物產(chǎn)單寧酶pH穩(wěn)定范圍一般在4～6之間［11］。當(dāng)混菌所分泌的單寧酶在pH為5時(shí)，有最強(qiáng)的活性。本研究中pH在5左右時(shí)，混菌對油茶粕中單寧的分解效果最顯著，表明此時(shí)混菌分泌的單寧酶有最強(qiáng)的活性。

本研究中，發(fā)酵起始溫度在28℃時(shí)，混菌對油茶粕中的單寧具有顯著降解效果。這與蘇二正等［12］、郭魯宏等［13］的研究報(bào)道結(jié)果相符。28～32℃為黑曲霉最佳發(fā)酵培養(yǎng)溫度范圍，可能因?yàn)楸狙芯恐性囼?yàn)是在三角瓶中發(fā)酵，過程中產(chǎn)生了大量的熱，而物料的熱傳導(dǎo)率低，導(dǎo)致短時(shí)間內(nèi)熱量難以消散；此外，在發(fā)酵過程中物料的收縮和空隙的減少也使熱量難以消除，起始發(fā)酵溫度稍低，經(jīng)過發(fā)酵后發(fā)酵瓶內(nèi)的溫度升高，酶活性增強(qiáng)。

表2 不同pH條件下不同菌種發(fā)酵后的油茶粕中單寧的含量

表3 不同發(fā)酵起始溫度條件下不同菌種發(fā)酵后的油茶粕中單寧的含量

［1］朱彬，鐘海雁.油茶活性成分研究進(jìn)展與展望 ［J］.經(jīng)濟(jì)林研究，2010，43（6）：27～31.

［2］呂遠(yuǎn)平，姚開，賈冬英.飼料中植物單寧的抗?fàn)I養(yǎng)性及其生物降解 ［J］.中國畜牧雜志，2009，39（2）：42～43.

［3］張曉慶，郝正里.植物單寧對反芻動物養(yǎng)分利用的影響 ［J］.飼料工業(yè)，2006，27（13）：44～46.

［4］Kenji A，Ryu S，Hiroshi N.Purification and some properties of yeast tannase ［J］.Agri Biol.Chem，1976，40（1）：79～85.

［5］李秧針，邱樹毅，保玉心，等.單寧酶發(fā)酵生產(chǎn)的研究進(jìn)展 ［J］.中國釀造，2008，6（3）：1～6.

［6］丁麗霞，黎繼烈，鐘海雁.N＋注入誘變黑曲霉選育單寧酶生產(chǎn)菌株 ［J］.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，（9）：141～147.

［7］黃文，石碧，姚開.植物單寧的生物降解 ［J］.化學(xué)通報(bào)，2002，（5）：321～323.

［8］王揮，張蕾，黎繼烈，等.響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)單寧酶條件 ［J］.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（11）：122～126.

［9］國家林業(yè)局.中華人民共和國林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《單寧酸分析試驗(yàn)方法》（LY／T1642－2005）［S］.

［10］張蓉嬌，吳天祥.六種中草藥提取液對姬松茸深層發(fā)酵的影響 ［J］.井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，9（5）：109～111.

［11］王揮，李應(yīng)洪，顏紅，等.單寧酶性質(zhì)及其分析方法研究進(jìn)展 ［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2012，4（8）：128～133.

［12］蘇二正，夏濤，張正竹.單寧酶的研究進(jìn)展 ［J］.茶業(yè)通報(bào)，2004，26（1）：16～19.

［13］郭魯宏.單寧酶的制備及酶法制取沒食子酸及其丙酯研究 ［D］.沈陽：中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，2001.