SP-D基因SNP與河南漢族人群肺結核相關性分析

雷冬梅，張 玲，楚天驕，李曉文，肖 海

1)鄭州大學第三附屬醫(yī)院病理科 鄭州450052 2)漯河醫(yī)學高等?？茖W校醫(yī)學生物學教研室 漯河462002 3)鄭州大學基礎醫(yī)學院細胞生物學與醫(yī)學遺傳學教研室 鄭州450052 4)鄭州大學人民醫(yī)院河南省醫(yī)學遺傳研究所 鄭州450002

SP-D 基因定位于10q22．2-23．1，與甘露糖結合蛋白和SP-A 基因相鄰［1］。目前SP-D 基因研究［2］大多集中于氨基酸殘基11 密碼子(SP-D11)和氨基酸殘基160 密碼子(SP-D160)多態(tài)性在肺部感染性疾病中的作用。已經發(fā)現眾多嚴重慢性和炎癥性肺部疾病患者血清中SP-D 水平升高，如間質性肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、特發(fā)性肺纖維化、囊性纖維化和嗜酸性肺炎等［3-4］。有研究［2］表明SP-D160 位點單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與潰瘍性結腸炎有關。Floros 等［5］研究發(fā)現在墨西哥人群中，SP-D11 位點等位基因C 是肺結核的危險性因素，SP-D160 位點則與肺結核發(fā)病無關。關于SP-D11 和SP-D160 位點SNP 與肺結核易感性之間的關系，國內尚無報道。作者通過對河南漢族人群中SP-D11 和SP-D160 位點SNP 進行研究，以期從分子水平上分析SP-D 與肺結核的相關性，探究河南漢族人群肺結核的易感基因。

1 對象與方法

1．1 研究對象 肺結核組:為2010年至2012年收集的197例來自河南新鄉(xiāng)、安陽及鄭州市結核病防治所的肺結核患者，男88例，女109例，年齡(36．5 ±15．3)歲，＜45歲136例，≥45歲61例;診斷均符合國家統一標準［6］，排除糖尿病、使用激素及免疫力低下的個體。對照組200例，男90例，女110例，年齡(32．1 ±14．6)歲，＜45歲134例，≥45歲66例，均為正常個體。以上研究對象之間無血緣關系，并均得到本人或監(jiān)護人知情同意。

1．2 SP-D11 和SP-D160 位點SNP 檢測 抽取研究對象的靜脈血3 mL，EDTA 抗凝，酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，應用引物特異性PCR(SSP-PCR)法進行檢測。引物序列(表1)來源于GenBank 和相關文獻［7］，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，同時設立內對照引物APC 和HLA-DRB1 作為質控引物。PCR 反應體系:模板DNA 2 μL，Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，補充去離子水至20 μL。PCR 擴增條件:96℃預變性1 min;96℃20 s，70℃45 s，72℃25 s，5個循環(huán);96℃25 s，65℃50 s，72℃30 s，21個循環(huán);96℃30 s，60℃55 s，72℃120 s，4個循環(huán);4℃保存。20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳:取PCR 產物8 μL 加入樣品孔，120 V 穩(wěn)壓電泳45 min。在凝膠成像儀紫外燈下觀察結果并保存圖像。

1．3 基因型判讀 瓊脂糖凝膠電泳中相鄰2個泳道為同一樣本的2種不同特異性引物的擴增體系，若2 份擴增體系均有目的條帶出現，則該樣本為雜合基因型;若僅有1 份體系擴增出目的條帶，則說明樣本為該特異性擴增引物的純合基因型。SP-D11位點擴增產物長度為200bp，質控條帶為800 bp;SP-D160 位點擴增產物長度為577 bp，質控條帶為200 bp。每個SNP 位點的3種基因型擴增產物各抽取2例，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

表1 引物序列

1．4 統計學處理 應用SHEsis 軟件http://analysis．bio-x．cn/myAnalysis．php 在線分析數據，并進行基因單倍型分析。應用SPSS 10．0 進行統計學分析，采用χ2檢驗比較2組基因型頻率和等位基因型頻率的差異，并計算比值比(OR 值)和95%置信區(qū)間(CI)，檢驗水準α=0．05。

2 結果

197例肺結核患者和200例正常對照者全部得到明確的基因型，SP-D11 位點有3種基因型CC、CT 和TT，SP-D160 位點有3種基因型AA、AG 和GG(圖1、2)，測序結果與電泳結果完全一致。SPD11 和SP-D160 位點等位基因頻率及基因型頻率分布和年齡分層分析結果見表2～7。

圖1 SP-D11 T/C 位點各基因型電泳圖

圖2 SP-D160 A/G 位點各基因型電泳圖

表2 SP-D11 基因型和等位基因在肺結核組和對照組的分布例(%)

表3 SP-D11 SNP 在肺結核組和對照組≥45歲人群中的比較例(%)

表4 SP-D11 SNP 在肺結核組和對照組＜45歲人群中的比較例(%)

表5 SP-D160 基因型和等位基因在肺結核組和對照組的分布例(%)

表6 SP-D160 SNP 在肺結核組和對照組≥45歲人群中的比較例(%)

表7 SP-D160 SNP 在肺結核組和對照組＜45歲人群中的比較例(%)

3 討論

結核病是由結核分枝桿菌引起的慢性傳染病之一，可累及全身多個臟器，但以肺結核最為常見［8］。最近的研究［9］表明:SP-D 不僅可以識別和清除肺內異物和凋亡細胞，而且在降低炎癥反應、抑制自身抗體的產生等方面也有重要作用?；蚨鄳B(tài)性可引起蛋白結構和功能上的改變，導致結核分枝桿菌感染者的不同轉歸，即不同個體對肺結核表現出不同的易感性［10］。該研究中SP-D 基因的2個SNP 位點均可能發(fā)生錯義突變，這些錯義突變可引起SP-D 蛋白結構和功能的改變，從而決定不同人群對肺結核的易感性不同。

因我國肺結核患者在45歲以下人群中明顯增多，故該研究以45歲為節(jié)點進行年齡分層分析。研究結果顯示，SP-D11 位點CC、TT 基因型在肺結核組中的分布頻率均低于對照組，CT 基因型在肺結核組中的分布頻率則高于對照組，且與年齡無關，表明該位點的基因型頻率與河南漢族人群肺結核發(fā)病有關。推測該基因不是肺結核發(fā)病的主基因，而只是在復雜的遺傳方式中起了較微弱的作用。

作者對SP-D160 位點進行基因型頻率與基因頻率分析，總體人群分析結果顯示其與河南漢族人群肺結核發(fā)病無關。但按年齡分層分析結果顯示，45歲以下人群A 等位基因在肺結核組的分布頻率高于對照組，提示此位點與45歲以下河南漢族人群肺結核發(fā)病有關，A 等位基因可能是河南漢族中青年人群肺結核發(fā)病的危險因素。目前國內外暫無SPD160 位點SNP 與肺結核之間相關性的報道，因此有必要擴大樣本量，進一步確定SP-D160 位點A 等位基因與肺結核的關系。

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