尋常型銀屑病皮損組織中NESTIN、NF-κBP65及STAT3蛋白的表達*

王 芳，李紅文#，鄭乃剛，吳景蘭

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院皮膚科 鄭州450052 2)鄭州大學基礎醫(yī)學院腫瘤基礎學教研室 鄭州450001 3)鄭州大學基礎醫(yī)學院分子生物學研究中心鄭州450001

銀屑病是一種慢性的、易復發(fā)的、與遺傳及多種環(huán)境刺激誘導等有關的自身免疫性皮膚病，比較常見，它以細胞的炎癥和增生為特征，表現為丘疹、紅斑、鱗屑。研究［1］發(fā)現干細胞是銀屑病表皮增殖的根源，Nestin 是干細胞的標志。核轉錄因子－κB(nuclear factor－kappa B，NF－κB)是一種真核細胞轉錄因子，可被IL－6、干擾素等激活，同時它也可以激活STAT3 磷酸化，靶向提高c－myc/cyclin D1 的表達而促進細胞增殖［2－5］。由于Nestin、NF－κB、STAT3 在正常表皮中均表達于基底層，基底層是角質形成和細胞增殖發(fā)生的重要部位，提示它們可能與細胞炎癥、增殖密切相關。該研究采用免疫組化方法檢測尋常型銀屑病患者皮損組織和正常皮膚組織中Nestin、NF－κBp65、STAT3 的表達，探討其在銀屑病發(fā)生和發(fā)展中的作用機制。

1 對象與方法

1．1 研究對象 選取2014年6月至2014年9月在鄭州大學第一附屬醫(yī)院皮膚科門診或住院治療的14例尋常型銀屑病患者的皮損組織標本。所有患者臨床表現典型，根據銀屑病皮損面積及嚴重程度評分(psoriasis area and severity index，PASI)標準［6］和組織病理學確診;其中男8例，女6例，年齡13～64(40．3 ±8．3)歲，病程7 d～36 a。取材部位:軀干及四肢的皮損，直徑0．6～0．9 cm?；颊?個月內未外用及內服治療銀屑病藥物。14例正常的皮膚組織取自該院整形科(正常對照組)，年齡19～40(21．7 ±3．0)歲，均無應用維甲酸類藥物史，無惡性腫瘤等其他系統(tǒng)性疾病。該研究經鄭州大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象或家屬對該研究知情并均簽署同意書。

1．2 主要試劑及儀器 Nestin、p－STAT3 抗體購自美國Santa Cruz 公司，NF－κBp65 抗體、SP 試劑盒和DAB 顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1．3 皮膚組織中Nestin、NF-κBp65、STAT3 蛋白表達的免疫組化檢測 獲取皮膚組織后均置于40 g/L 多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)0．5 μm 厚切片，常規(guī)脫蠟、水化，消除內源性過氧化物酶，繼而進行抗原修復，以正常山羊血清封閉［7］，加Nestin、NF－κBp65、STAT3 一抗工作液(均按1 ∶50稀釋)，同時以PBS 代替一抗作為空白對照，顯微鏡下觀察并攝像，用BI－2000 型全自動圖像處理系統(tǒng)掃描免疫染色信號，測定光密度值。

1．4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17．0 進行分析，應用兩獨立樣本的t 檢驗比較2組間Nestin、NF－κBp65、STAT3 蛋白表達的差異，應用Pearson 相關性分析確定尋常型銀屑病患者皮損組織中或正常皮膚組織中NF－κBp65 與STAT3 表達的關聯(lián)性，檢驗水準α =0．05。

2 結果

2．1 皮膚組織中Nestin、NF-κBp65 和STAT3 蛋白的定位及表達 見圖1、表1。尋常型銀屑病皮損表皮細胞過度增殖，表現為棘細胞體積肥大、毛細血管擴張充血等。正常表皮組織的基底細胞呈柱形。尋常型銀屑病皮損組織和正常皮膚組織中Nestin 蛋白的陽性信號定位于基底干細胞的胞質內，信號呈棕色顆粒;前者表達較多、較強，后者表達較少、較弱。尋常型銀屑病皮損組織和正常皮膚組織中NFκBp65 蛋白的陽性信號主要定位于部分基底細胞和棘層細胞的胞核及胞質中，信號呈棕色顆粒;前者表達較多、較強，后者表達較少、較弱。尋常型銀屑病皮損組織和正常皮膚組織中STAT3 蛋白的陽性信號定位于基底細胞和幾乎全層棘細胞的胞核/胞質中，信號呈棕色顆粒;前者表達較多、較強，后者表達較少、較弱。

圖1 正常對照組和銀屑病患者皮膚組織中Nestin、NF-κBp65、STAT3 蛋白的表達(SP，×400)

表1 兩種皮膚組織中Nestin、NF-κBp65 及STAT3 蛋白表達的比較

2．2 兩種皮膚組織中NF-κBp65 與STAT3 表達的相關性 在尋常型銀屑病患者皮損組織和正常皮膚組織中NF－κBp65 與STAT3 的表達均呈相關，r 分別為0．960 和0．829，P＜0．001。

3 討論

銀屑病是一種慢性、反復發(fā)作的自身免疫性皮膚病，其確切的病因不明，有研究［8］報道與基因、激素、感染因素有關，銀屑病表現為表皮角質形成細胞異常增殖、分化不良［9］。

該實驗結果顯示:在尋常型銀屑病皮損組織和正常皮膚組織中Nestin、NF－κBp65 及STAT3 蛋白分別定位于基底干細胞的胞質內、基底細胞和棘層細胞的胞核及胞質內、基底細胞和幾乎全層棘細胞的胞核/胞質內，均呈棕色顆粒，這3種蛋白在尋常型銀屑病皮損組織中的陽性表達信號較多、較強，棕色顆粒常呈聚集狀。

Nestin 作為一種中間絲蛋白，廣泛分布于各組織細胞中，在胚胎發(fā)育早期發(fā)揮著重要作用，在血管生長和新生血管形成中發(fā)揮著重要作用，也是銀屑病干細胞的標志之一。NF－κB 可被氧化應激、免疫反應以及細胞增殖等激活［10］，其為二聚體，由NFκBp65(RelA/p65)和NF－κBp50 兩個單體合成，其中激活的NF－κBp65 和組蛋白脫乙酰化酶(HDAC)在NF－κBp65 的DNA 結合活性之間起關聯(lián)作用，可啟動腫瘤發(fā) 生［11－12］，在癌細胞中HDAC 抑制物(HDACi)可抑制NF－kBp65 的DNA 結合活性;有研究［13］報道，通過NF－κB 的失活和Caspase 的激活可誘導癌細胞凋亡。因此，HDACi 可抑制癌細胞或細胞增殖，提示其對銀屑病的治療也有新的希望。作者應用NF－κBp65 抗體檢測尋常型銀屑病皮損組織中NF－κBp65 蛋白的表達情況，發(fā)現其分布于上皮基底細胞及多數棘細胞內，比在正常皮膚組織表達較強。NF－κB 可誘導炎癥因子IL－6 上調，協(xié)同干擾素促進STAT3 及STAT5 磷酸化，從而靶向提高cmyc 基因協(xié)同Cyclin D1 的上調，而導致角質形成細胞的增殖［2－5，14］。尋常型銀屑病的干細胞是細胞增殖的根源，NF－κB 可被炎癥因子、ROS 等激活，同時該炎癥因子也可激活JAK－STAT 信號轉導，主要是激活STAT3 的磷酸化，即STAT3 也反映了炎癥的程度。有學者［15］發(fā)現STAT3 的表達水平是由NFκB 的激活強度所誘導。該研究結果顯示:銀屑病或正常皮膚組織中NF－κBp65 與STAT3 的陽性表達呈正相關，與上述文獻相一致，提示它也是尋常型銀屑病治療的靶點。

該實驗比較了尋常型銀屑病與正常皮膚組織中Nestin、NF－κB 和STAT3 蛋白的定位及表達水平，為銀屑病的預防和治療提供了新的理論基礎和參考指標，因此應用藥物或其他措施抑制NF－κB 及STAT3的表達可能會成為治療銀屑病的新方向。但該實驗也存在一定的不足(病例數較少)，有待進一步擴大樣本深入研究。

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