潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道菌群分析和細(xì)菌毒素基因檢測*

牛 敏，邵天波，陳瑞春，杜 艷

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科昆明650000

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性結(jié)腸炎癥，臨床癥狀有腹痛、腹瀉、黏液血便等［1］，目前尚無法完全治愈。UC 在北美和歐洲患病率高于亞洲國家［2］。近年來，其在我國的患病率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，目前約為11．6/105［3-4］。UC 致病機(jī)制復(fù)雜，包括遺傳易感性、免疫調(diào)節(jié)異常、腸黏膜屏障功能障礙和腸道微生態(tài)改變等［5］。研究顯示，UC 患者存在不同程度的菌群失調(diào)［6-8］，某些條件致病菌在UC 患者腸道中的檢出率明顯高于健康人群［9-11］。腸道致病菌的毒素基因一般不表達(dá)，只有被誘導(dǎo)激活后，才產(chǎn)生大量毒素，引起腸道炎癥及腹痛腹瀉等癥狀［12-14］。該研究收集明確診斷的UC 患者和正常人的新鮮糞便標(biāo)本，首先進(jìn)行腸道菌群分布的分析，然后檢測糞便中多種常見條件致病菌毒素基因，為UC 的發(fā)病機(jī)制和益生菌治療的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 標(biāo)本來源 53例UC 確診病例來自昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年至2013年消化科住院患者，經(jīng)結(jié)腸鏡及病理檢查，符合2007年中華消化學(xué)會制定的《對我國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識意見》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。根據(jù)疾病活動指數(shù)，活動期32例，男17例，女15例，年齡(47．7 ±13．0)歲;緩解期21例，男14例，女7例，年齡(45．9 ±13．0)歲。45例對照為該院2012年至2013年體檢中心體檢健康者，男27例，女18例，年齡(45．8 ±12．2)歲，無消化道慢性疾病史，常規(guī)體檢和糞便常規(guī)檢查均未見異常。所有研究對象留取標(biāo)本前4 周內(nèi)均未應(yīng)用抗生素或微生態(tài)制劑等可能影響腸道菌群的藥物。采集新鮮糞便標(biāo)本10 g，2 h 內(nèi)直接涂片并接種于哥倫比亞血平板和麥康凱平板;另留取200 mg 置于－80℃冰箱保存，以待細(xì)菌毒素基因的檢測。

1．2 主要儀器和試劑

1．2．1 儀器 Nikon50i 顯微鏡圖文系統(tǒng)(日本Nikon 公司)，VITEK 2 全自動細(xì)菌鑒定儀(法國梅里埃公司)，MyCyclerTMthermal Cycler DNA 擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad 公司)等。

1．2．2 試劑 哥倫比亞血平板和麥康凱平板(鄭州安圖綠科生物工程有限公司)，革蘭染液、厭氧氣體發(fā)生袋、GN 鑒定卡、GP 鑒定卡和API 20A 厭氧菌鑒定卡(法國梅里埃公司)，糞便DNA組提取試劑盒(離心柱型)、HotMaster PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司)，引物合成由上海Invitrogen 公司完成。

1．3 直接涂片鏡檢和菌群分析 新鮮糞便涂片，面積約1．5 cm ×2．0 cm，厚度如血膜的菌膜，干燥固定后革蘭染色，油鏡下觀察10個視野，根據(jù)每油鏡視野細(xì)菌總數(shù)和各類細(xì)菌比例，判斷是否存在菌群失調(diào)及菌群失調(diào)程度，判斷和分級標(biāo)準(zhǔn)參照《腸道菌群糞便涂片檢查圖譜》［15］。

1．4 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定 用10 μL 接種環(huán)挑取一環(huán)糞便標(biāo)本，采用四區(qū)劃線的方法進(jìn)行接種。①需氧培養(yǎng):接種血平板和麥康凱平板，在含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃有氧環(huán)境中孵育24 h。使用VITEK 2 全自動細(xì)菌鑒定儀對血平板上生長的優(yōu)勢菌進(jìn)行菌種鑒定。用麥康凱平板篩查沙門菌和志賀菌。②厭氧培養(yǎng):接種厭氧血平板，在37℃無氧環(huán)境中(厭氧氣體發(fā)生袋)孵育48 h，挑取優(yōu)勢菌做耐氧試驗，專性厭氧菌用API 20A 厭氧菌鑒定卡鑒定。

1．5 細(xì)菌毒素基因的檢測 采用糞便DNA組提取試劑盒(離心柱型)抽提糞便總DNA，具體方法按試劑盒說明書操作。提取的DNA 于－20℃保存。待測的毒素基因包括:腸侵襲型大腸埃希菌(EIEC)毒力因子vira 基因，腸產(chǎn)毒型大腸埃希菌(ETEC)的熱不穩(wěn)定毒力因子LT 基因，產(chǎn)氣莢膜梭菌外α 毒素(cpa)基因，擬桿菌腸毒素bft 基因，艱難梭菌毒素A(cdtA)基因，艱難梭菌毒素B(cdtB)基因，引物序列見表1。擴(kuò)增體系:Mix 12．5 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，水9．5 μL。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性15 min;95℃變性10 s，58～64℃退火、延伸30 s，40個循環(huán)。退火溫度分別為:GAPDH 62℃，vira 64℃，LT 62℃，cpa 61℃，bft 63℃，cdtA 60℃，cdtB 58℃。擴(kuò)增反應(yīng)體系和退火溫度參考文獻(xiàn)［16］。擴(kuò)增產(chǎn)物用20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳純化后送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序，將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對。

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19．0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，涂片菌群失調(diào)率、細(xì)菌優(yōu)勢生長率、毒素基因檢出率的比較采用χ2檢驗或精確概率法，涂片菌群失調(diào)程度分析采用秩和檢驗;檢驗水準(zhǔn)α=0．05。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2．1 菌群分析 UC 活動期組菌群失調(diào)率為87．5%(28/32)，UC 緩解期組為81．0%(17/21)，對照組為53．3%(24/45)，3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11．904，P=0．003);UC 活動期組與UC 緩解期組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P =0．698);UC 活動期組高于對照組(χ2=9．957，P =0．003)，UC 緩解期與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 0．424，P=0．515)。UC 活動期組菌群失調(diào)嚴(yán)重程度高于UC緩解期組，見表2。

表2 UC 活動期和緩解期組菌群失調(diào)程度的比較例

2．2 細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定

2．2．1 需氧培養(yǎng) 優(yōu)勢菌見表3。3組大腸埃希菌和條件致病菌優(yōu)勢生長率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。UC組總的大腸埃希菌優(yōu)勢生長率(66．0%)明顯低于對照組(88．9%，χ2=7．075，P=0．008)，條件致病菌優(yōu)勢生長率(32．1%)明顯高于對照組(11．1%，χ2=6．144，P=0．013)。

2．2．2 厭氧培養(yǎng) 優(yōu)勢菌見表4。3組大腸埃希菌、益生菌和條件致病菌優(yōu)勢生長率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 3組需氧培養(yǎng)的優(yōu)勢菌例

表4 3組厭氧培養(yǎng)的優(yōu)勢菌例

2．3 細(xì)菌毒素基因的檢測 6種細(xì)菌毒素基因在3組標(biāo)本中均有檢出，PCR 電泳圖見圖1。與BLAST比對結(jié)果顯示，產(chǎn)物片段沒有缺失，序列100%比對成功。各毒素基因檢出率見表5。由于各毒素基因檢出率較低，因此，統(tǒng)計了6種毒素基因的總檢出率。UC組毒素基因總檢出率(41．5%)高于對照組(22．2%，χ2=4．117，P =0．042)，但UC 活動期組(40．6%)與緩解期組(42．9%)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0．451，P=0．502)。

表5 3組各毒素基因的檢出率例

圖1 各毒素基因PCR 電泳圖

3 討論

UC 的致病機(jī)制復(fù)雜，腸道菌群失調(diào)可能是誘發(fā)和維持結(jié)腸炎癥的主要原因［17］。該研究中，作者首先通過涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)UC 活動期組菌群失調(diào)率明顯高于對照組，UC 活動期組菌群失調(diào)程度也明顯高于緩解期組，提示UC 患者腸道菌群狀況與病情發(fā)展密切相關(guān)，緩解期患者結(jié)腸炎癥的復(fù)發(fā)可能與腸道菌群失調(diào)的加重有關(guān)。

糞便需氧培養(yǎng)結(jié)果顯示，變形桿菌屬、克雷白桿菌屬、陰溝腸桿菌、腸球菌屬和溶血性鏈球菌等條件致病菌在UC組中的優(yōu)勢生長率明顯高于對照組。上述條件致病菌數(shù)量的增多可能與UC 相關(guān)，但是否與患者病情相關(guān)仍不明確。厭氧培養(yǎng)結(jié)果顯示，3組大腸埃希菌、益生菌及條件致病菌的優(yōu)勢生長率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。但值得注意的是，UC 患者中共檢出7例梭菌屬優(yōu)勢生長，這與Andoh 等［7］的研究結(jié)果相反，因此UC 與梭菌屬的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。培養(yǎng)結(jié)果表明，UC 患者腸道條件致病菌增多，存在菌群失調(diào)，與涂片分析結(jié)果一致。

細(xì)菌毒素基因檢測結(jié)果顯示，LT 基因只在UC組中檢出，檢出率為5．56%，提示產(chǎn)毒型大腸埃希菌可能與UC 關(guān)系密切。各毒素基因在UC組和對照組中檢出率均較低，但是UC 患者糞便中毒素基因的總檢出率高于對照組，提示UC 患者腸道中多種條件致病菌的毒素基因共同存在，容易形成菌群失調(diào)，與培養(yǎng)結(jié)果一致。

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