5-ALA介導的光動力療法對人舌鱗癌TCA8113細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響*

王 桃，劉偉偉，謝 冰，張 瑞，張 朋#

1)鄭州大學口腔醫(yī)學院修復科 鄭州450052 2)鄭州市口腔醫(yī)院綜合科 鄭州450099 3)鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院口腔科鄭州450007

光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是一種聯(lián)合光敏劑及相應光源，通過光動力作用選擇性破壞病變組織的臨床治療手段［1］。5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)屬于第2 代光敏劑，是一種內(nèi)源性光動力治療藥物。作者將5-ALA 介導的PDT(5-ALA-PDT)作用于體外培養(yǎng)的人舌鱗癌Tca8113 細胞，觀察其對細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響，為5-ALA-PDT 用于舌鱗癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 主要材料 5-ALA(上海復旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司)，MTT、DMSO(Sigma 公司)，Tca8113 細胞(第四軍醫(yī)大學組織工程中心贈予)，細胞凋亡、細胞周期檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，胎牛血清(Gibco 公司)。PDTLAS 半導體激光治療儀(上海復旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司)，多功能酶標儀(Bio-Rad 公司)，倒置顯微鏡(Olympus 公司)，流式細胞檢測儀(Beckman 公司)。

1．2 5-ALA-PDT 對Tca8113 細胞形態(tài)影響的觀察取對數(shù)生長期Tca8113 細胞，按2×104mL－1密度接種于96 孔板中，24 h 后進行分組及處理［正常對照組、僅光照組、僅光敏劑組(5．00 mmol/L 5-ALA)、低濃度5-ALA-PDT組(0．05 mmol/L 5-ALA+PDT 治療)、高濃度5-ALA-PDT組(5．00 mmol/L 5-ALA+PDT治療)］。各組細胞經(jīng)處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于倒置顯微鏡下(×200)觀察細胞生長狀況。

1．3 MTT 法檢測5-ALA-PDT 對Tca8113 細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期Tca8113 細胞，按2 ×105mL－1密度接種于96 孔板中，37℃培養(yǎng)24 h，吸出含血清的培養(yǎng)液，PBS 液輕漂后棄去，于暗室中分別加入0．01、0．05、0．10、0．50、1．00、5．00、10．00 mmol/L的5-ALA，各劑量組依次孵育1、2、3、4、6、8 h，然后用波長635 nm、光能量密度4 J/cm2的激光進行光照刺激［2］。同時設立不施加任何干預的對照組。每組4個復孔。給予干預后各孔補加100 μL 含體積分數(shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入MTT 液20 μL，37℃避光孵育4 h，后棄去上層液體，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min 后混勻，然后用酶標儀于490 nm 波長處檢測各組細胞的吸光度值。

1．4 流式細胞儀檢測5-ALA-PDT 對Tca8113 細胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期Tca8113 細胞，按5 ×105mL－1密度接種于6 孔板中，每孔500 μL，37℃培養(yǎng)24 h，吸出含血清的培養(yǎng)液，PBS 液輕漂后棄去。實驗分組:O組(正常對照組);A組(0．05 mmol/L 光敏劑);B組(0．50 mmol/L 光敏劑);C組(5．00 mmol/L 光敏劑)。藥物組給予波長635 nm、光能量密度4 J/cm2的激光進行光照刺激2 h，然后各孔補加100 μL 含體積分數(shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各組細胞胰蛋白酶消化后用PBS洗滌2次，收集(1～5)×105個細胞，加入500 μL 的Binding Buffer 懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，加入5 μL Propidium Iodide 混勻，室溫避光反應10 min，上流式細胞儀檢測。每組重復3次。

1．5 流式細胞儀檢測5-ALA-PDT 對Tca8113 細胞周期的影響 取對數(shù)生長期細胞，按5 ×105mL－1密度接種于6 孔板中，每孔500 μL，37℃培養(yǎng)24 h。實驗分組:D組用5-ALA-PDT 處理細胞(0．5 mmol/L 5-ALA 作用2 h，光照刺激同1．3)，E組不施加任何干預。24 h 后收集細胞，用PBS 洗滌2次，制備的單細胞懸液用體積分數(shù)70%乙醇固定，4℃保存，染色前用PBS 洗去固定液，加100 μL RNase A 37℃水浴30 min，再加入400 μL PI 染液混勻，4℃避光30 min，上流式細胞儀檢測并記錄結果。每組重復3次。

1．6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17．0 進行數(shù)據(jù)分析。各組間Tca8113 細胞增殖情況的比較采用析因設計的方差分析;4組間Tca8113 細胞凋亡率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗;2組間Tca8113 細胞周期的比較采用兩獨立樣本的t 檢驗。檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 5-ALA-PDT 對Tca8113 細胞形態(tài)的影響 見圖1。可見，單純光照和光敏劑作用于細胞，細胞形態(tài)無明顯變化;當5-ALA-PDT 作用于細胞時細胞形態(tài)改變明顯，細胞體積變小，皺縮變圓，甚至出現(xiàn)裂解;高濃度5-ALA-PDT組細胞形態(tài)的改變較低濃度5-ALA-PDT組明顯。

圖1 5-ALA-PDT 對Tca8113 細胞形態(tài)的影響(×200)

2．2 5-ALA-PDT 對Tca8113 細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響 見表1～3。

表1 5-ALA-PDT 對Tca8113 細胞增殖的影響(n=4)

表2 5-ALA-PDT對Tca8113 細胞凋亡的影響(n=3) %

表3 5-ALA-PDT 對Tca8113 細胞周期的影響(n=3) %

3 討論

PDT 已經(jīng)應用于臨床治療多種疾病，尤其是腫瘤疾?。?］。與腫瘤傳統(tǒng)手術、化療和放療方法相比，PDT 的優(yōu)點是能選擇性地消滅局部的原發(fā)和復發(fā)腫瘤，而不傷及正常組織;并可與化療和放療同時進行，且均具有一定的協(xié)同作用;另外還可縮小手術的范圍和改善患者的愈后［4］。有學者［5-7］將Photofrin 等光敏劑單獨或者聯(lián)合手術、放療用于舌癌的臨床治療，取得了很好的近期效果。5-ALA 是一種內(nèi)源性光敏劑，近年來因其不良反應少、避光時間短等優(yōu)點受到廣泛重視［8-9］。該課題組之前的研究［10］表明，5-ALA-PDT 對舌鱗癌細胞具有殺傷效應。

該實驗中通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，當光敏劑、激光分別單獨作用于Tca8113 細胞時，細胞形態(tài)無明顯變化;當5-ALA-PDT 作用于Tca8113 細胞時細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞體積減小，由多邊形皺縮為圓形，細胞間隙增大，細胞結構不清晰，甚至出現(xiàn)裂解。5-ALA-PDT 所致的細胞形態(tài)的改變與宗麗菊等［11］采用PDT 誘導的人宮頸永生化上皮H8 細胞形態(tài)改變是一致的。這說明5-ALA-PDT 對舌鱗癌細胞的形態(tài)有影響，可能誘發(fā)細胞凋亡。利用MTT 法檢測發(fā)現(xiàn)，5-ALA-PDT 作用的各組吸光度值均低于對照組，說明5-ALA-PDT 能夠抑制Tca8113 細胞的增殖。該實驗還利用流式細胞儀檢測了5-ALA-PDT對Tca8113 細胞凋亡的影響，結果顯示PDT 作用各組凋亡及壞死率均比對照組高。這說明5-ALA-PDT能夠誘導Tca8113 細胞凋亡，抑制細胞增殖，甚至誘導細胞壞死。在對細胞周期的檢測中發(fā)現(xiàn)，5-ALAPDT 干預后G0/G1期細胞所占百分比高于對照組，S 期細胞低于對照組，G2/M 期細胞略低于對照組，表明5-ALA-PDT 干擾了細胞周期中G0/G1期向S期轉變的階段，從而抑制了細胞的代謝和增殖。此與光鏡下觀察到的細胞形態(tài)改變及細胞增殖實驗結果相一致。

綜上所述，5-ALA-PDT 對Tca8113 細胞有確切的殺傷作用。在一定濃度范圍內(nèi)，其殺傷作用隨著5-ALA 濃度的遞增而增加，且該作用存在濃度飽和現(xiàn)象。這種殺傷是通過誘導細胞凋亡產(chǎn)生的，并且5-ALA-PDT 通過干擾細胞周期的G0/G1期而抑制細胞的增殖，提示5-ALA-PDT 在口腔舌鱗癌的治療中可以起重要作用。

［1］Donnelly RF，McCarron PA，Woolfson AD．Derivatives of 5-aminolevulinic acid for photodynamic therapy［J］．Perspect Medicin Chem，2007，1:49

［2］Chen HM，Liu CM，Yang H，et al．5-aminolevulinic acid induce apoptosis via NF-κB/JNK pathway in human oral cancer Ca9-22 cells［J］．J Oral Pathol Med，2011，40(6):483

［3］McCaughan JS Jr．Photodynamic therapy:a review［J］．Drug Aging，1999，15(1):49

［4］高社干，魏洛霞，王立東，等．腫瘤光動力治療的研究現(xiàn)狀與展望［J］．鄭州大學學報:醫(yī)學版，2008，43(3):405

［5］繆景霞，周瑾，張甫婷．舌癌患者光動力療法治療的健康指導［J］．解放軍護理雜志，2003，20(12):84

［6］郭子倩，牛立志，何衛(wèi)兵，等．光動力學療法治療舌癌:附20例報告［J］．中國激光醫(yī)學雜志，2007，16(5):296

［7］李黎波，謝劍明，陳錦章，等．Photofrin 光動力治療舌癌的臨床觀察［J］．臨床腫瘤學雜志，2010，15(12):1119

［8］Manivasager V，Heng PW，Hao J，et al．Macro-microscopic fluorescence imaging of human NPC xenografts in a murine model using topical vs intravenous administration of 5-aminolevulinic acid［J］．Int J Oncol，2002，21(5):1003

［9］Kelleher DK，Bastian J，Thews O，et al．Enhanced effects of aminolaevulinic acid-based photodynamic therapy through local hyperthermia in rat tumours［J］．Br J Cancer，2003，89(2):405

［10］張瑞，張朋，劉偉偉．5-氨基酮戊酸對人舌鱗癌Tca8113細胞株體外光動力殺傷作用的基礎研究［J］．醫(yī)藥論壇雜志，2013，34(10):9

［11］宗麗菊，張友忠，王頡，等．四甲基吡啶卟啉-光動力療法對人宮頸永生化上皮H8 細胞的作用［J］．山東大學學報:醫(yī)學版，2015，53(1):21