妊娠期糖尿病大鼠胰腺組織中P-PERK、ATF4和CHOP蛋白的表達(dá)*

豐樹煥，張東銘，樂(lè) 婷，張?zhí)K河#，付艷芹

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州450014 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州450014

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期間首次發(fā)生的不同程度的糖代謝異常，可致母兒嚴(yán)重的并發(fā)癥。GDM 是一種多因素疾病，其病因復(fù)雜，胰島素抵抗和胰島β 細(xì)胞凋亡是目前GDM 發(fā)病機(jī)制中研究較多的因素。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是近年來(lái)1型、2 型糖尿病發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)，但在GDM 中研究較少。ERS 可促進(jìn)胰島素抵抗和β 細(xì)胞凋亡，蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)-C/EBP 同源蛋白(CHOP)作為ERS 經(jīng)典的信號(hào)通路，在胰島β 細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用［1］。作者通過(guò)觀察GDM 模型大鼠胰腺組織中磷酸化PERK(p-PERK)及ATF4 蛋白活化的情況，并分析ATF4 與凋亡相關(guān)蛋白CHOP表達(dá)的相關(guān)性，了解p-PERK、ATF4、CHOP 蛋白活化在GDM 胰島β 細(xì)胞凋亡發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料 SPF 級(jí)健康雌性SD 大鼠30只購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，平均周齡為4 周，平均體重為(110．8±14．9)g。普通飼料(標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類)和高脂高糖飼料［1］均購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1．2 動(dòng)物分組及GDM 大鼠模型建立 所有雌性SD 大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，時(shí)間標(biāo)記為W1，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為2組:模型組和對(duì)照組，每組15只，分別給予高脂高糖飼料和普通飼料。喂養(yǎng)6周后，記為W7，按2∶1 與雄性SD 大鼠合籠，次晨陰道涂片鏡檢精子(+)計(jì)為孕1 d。標(biāo)記并隔離孕鼠。合籠1 周后測(cè)定非空腹血糖，如血糖濃度≥6．7 mmol/L 則模型復(fù)制成功［2］，棄用未孕及血糖未達(dá)標(biāo)大鼠，2組大鼠妊娠1 周后記為W9。

1．3 標(biāo)本采集與方法

1．3．1 標(biāo)本采集 妊娠第21天所有大鼠隔夜禁食12 h 后，體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛腹腔麻醉，一側(cè)頸動(dòng)脈及對(duì)側(cè)股靜脈插管行靜脈葡萄糖耐量(IVGTT)及靜脈胰島素釋放實(shí)驗(yàn)(IVIRT)。結(jié)束后放血處死動(dòng)物，快速分離胰腺組織，一部分置于甲醛溶液中固定，以備HE 染色、細(xì)胞凋亡及免疫組化檢測(cè)使用;一部分置－80℃冰箱以備Western blot 使用。

1．3．2 HE 染色 取胰腺組織后常規(guī)石蠟包埋、切片，HE 染色后觀察胰腺組織的病理組織學(xué)變化。

1．3．3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 每只大鼠取切片1 張，按照凱基TUNEL 細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作。細(xì)胞核呈深棕色為染色陽(yáng)性細(xì)胞，即為凋亡細(xì)胞。每張切片選取5個(gè)視野(×400)，分別計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1．3．4 p-PERK 蛋白的檢測(cè) 采用免疫組化SP法。石蠟包埋大鼠胰腺組織，2～3 μm 切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，PBS 沖洗3次，高壓抗原修復(fù)5 min，自然冷卻，PBS 沖洗3次，用二抗同源血清進(jìn)行封閉，甩掉血清，滴加p-PERK 兔抗鼠多克隆一抗(稀釋100 倍使用)(上海拜力生物科技有限公司)50 μL，室溫下孵育1 h;滴加二抗50 μL，室溫孵育15 min。DBA 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明及封片。

1．3．5 ATF4、CHOP 蛋白檢測(cè) 采用Western blot方法。胰腺組織剪成小塊，按每20 mg組織加100～200 μL 的比例加入蛋白裂解液，14 000 r/min ×5 min，取上清。BCA 法初步測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，每孔上樣量30 μg，樣品分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，100 V 恒壓1 h20 min，硝酸纖維素封閉，TBST 洗膜。分別加入ATF4、CHOP 一抗，4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST 洗膜，加入二抗37℃孵育45 min，TBS 洗膜、蒸餾水漂洗后，ECL 顯影，暗室壓片。以β-actin 為內(nèi)參對(duì)照。將膠片掃描后用Bandscan 5．0 軟件進(jìn)行灰度分析。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20．0 處理數(shù)據(jù)，2組大鼠不同時(shí)間血糖和血胰島素水平比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。2組大鼠胰腺組織中p-PERK、ATF4、CHOP 蛋白表達(dá)水平的比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。模型組大鼠胰腺組織中ATF4 和CHOP 蛋白的相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 2組大鼠不同時(shí)間血糖值比較 2組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，血糖值無(wú)顯著差異，對(duì)應(yīng)飼料喂養(yǎng)6周后，模型組大鼠的血糖值高于對(duì)照組;妊娠1 周后，模型組大鼠血糖值高于對(duì)照組，見(jiàn)表1。

表1 2組大鼠不同時(shí)間血糖值比較 mmol/L

2．2 2組大鼠妊娠第21天時(shí)血糖和血胰島素水平比較 模型組大鼠第一時(shí)相胰島素分泌受抑制，胰島素分泌峰值延遲。見(jiàn)表2。

表2 2組大鼠妊娠第21天時(shí)的血糖、血胰島素值比較

2．3 2組大鼠胰腺病理組織學(xué)觀察 對(duì)照組胰島形態(tài)尚規(guī)則，有少許出血發(fā)生，可見(jiàn)少許空泡變性發(fā)生;模型組胰島形態(tài)欠規(guī)則，胰島數(shù)目減少不明顯，細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞呈空泡變性，出現(xiàn)核固縮和裂解，可見(jiàn)以淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，有出血發(fā)生，見(jiàn)圖1。

圖1 2組大鼠胰腺病理組織學(xué)觀察(HE，×400)

2．4 2組大鼠胰腺組織中細(xì)胞凋亡水平 2組大鼠胰腺細(xì)胞凋亡情況見(jiàn)圖2。模型組大鼠細(xì)胞凋亡率［(18．55 ±1．29)%］較對(duì)照組［(8．47 ±0．78)%］升高(t=21．164，P＜0．001)。

圖2 2組大鼠胰腺細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，×400)

2．5 2組大鼠胰腺組織中p-PERK 蛋白的表達(dá)對(duì)照組大鼠胰腺組織p-PERK 蛋白的表達(dá)水平為(0．297 ±0．010)，低于模型組的(0．615 ±0．020)(t=44．178，P＜0．001)。見(jiàn)圖3。

圖3 2組大鼠胰腺組織p-PERK 蛋白的表達(dá)情況(SP，×400)

2．6 2組大鼠胰腺組織中ATF4 及CHOP 蛋白的表達(dá) 見(jiàn)圖4。與對(duì)照組相比，模型組大鼠胰腺組織中ATF4 蛋白和凋亡蛋白CHOP 的表達(dá)水平分別為(0．57 ± 0．02)和(0．51 ± 0．03)，高于對(duì)照組 的(0．18±0．03)和(0．22 ±0．04)(t =49．249 和39．664，P＜0．001)。模型組大鼠胰腺組織中ATF4 和CHOP蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0．810，P=0．004)。

圖4 2組大鼠胰腺組織中ATF4 和CHOP 蛋白的表達(dá)

3 討論

由于需要合成和分泌大量的胰島素，β 細(xì)胞具有一系列獨(dú)特的功能，其中之一就是具有高度發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)，后者是蛋白質(zhì)生物合成、折疊及運(yùn)輸?shù)闹匾?xì)胞器，也是鈣離子的儲(chǔ)存庫(kù)。當(dāng)各種刺激引起未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在ER 蓄積，機(jī)體將啟動(dòng)保護(hù)性機(jī)制即未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，簡(jiǎn)言之，UPR 通過(guò)減少新合成蛋白質(zhì)向ER 運(yùn)輸或增加蛋白折疊能力，最終恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。然而，如刺激因素持續(xù)存在，將激活凋亡通路進(jìn)而導(dǎo)致β 細(xì)胞凋亡，這種轉(zhuǎn)變稱為ERS［3-4］。已有研究［5-6］證明ERS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與多種疾病密切相關(guān)，如肥胖、糖尿病、神經(jīng)退行性病變、缺血性疾病、腫瘤等。目前廣泛接受的與ERS 凋亡相關(guān)的通路包括:IRE1α 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)通路及CHOP 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)通路，后者在各型糖尿病中均有研究，但在GDM 中研究較少。

PERK 是ER 膜上的一種Ⅰ型跨膜蛋白，當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)，PERK 通過(guò)寡聚化和自身磷酸化，進(jìn)而抑制真核生物翻譯起始因子eIF2α 的磷酸化，即可以抑制幾乎所有的mRNA 的轉(zhuǎn)錄，然而卻可以誘導(dǎo)如ATF4 mRNA 的翻譯，ATF4 繼而調(diào)控ATF3、CHOP和Tribbles 同源蛋白3 的表達(dá)［7］，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。ERS 時(shí)，PERK、IRE1 和ATF6 都能誘導(dǎo)CHOP 的轉(zhuǎn)錄，PERK-eIF2α-ATF4 是CHOP 蛋白所必需的［8］。Eizirik 等［9］在糖尿病動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，CHOP 基因敲除的Akita 小鼠ERS 誘導(dǎo)的β 細(xì)胞凋亡減少，從而延遲糖尿病的發(fā)生，因此，CHOP 是持續(xù)性ERS 誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵啟動(dòng)因子和標(biāo)志物。

該研究結(jié)果中IVGTT 及IVIRT 結(jié)果反映出模型組大鼠第一時(shí)相胰島素分泌受抑，胰島素延遲釋放;β 細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組升高，提示高脂高糖飲食可致胰島β 細(xì)胞功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。胰腺病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)模型組有空泡變性，提示高脂高糖對(duì)胰島有損害作用。在高血糖刺激下，β 細(xì)胞仍能分泌較多的胰島素以滿足需要，表現(xiàn)為血胰島素水平升高。但長(zhǎng)期高脂飲食對(duì)胰島畢竟有損害，故表現(xiàn)為β 細(xì)胞分泌胰島素能力相對(duì)不足。胰腺組織p-PERK 蛋白在模型組大鼠表達(dá)明顯增加，說(shuō)明高脂高糖飲食可以誘導(dǎo)ERS 的發(fā)生。模型組大鼠胰腺組織ATF4、CHOP 蛋白表達(dá)均升高，且ATF4 與CHOP 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，ATF4 誘導(dǎo)下游CHOP 蛋白表達(dá)升高是細(xì)胞由自噬轉(zhuǎn)向凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，與Matsumoto 等［10］的研究結(jié)果一致。

綜上所述，可以認(rèn)為高脂高糖飲食誘導(dǎo)ERS 的發(fā)生，PERK-ATF4-CHOP 通路被激活，PERK 通路的活化與GDM β 細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，CHOP 基因的過(guò)度表達(dá)可能在β 細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用。

［1］郭嘯華，劉志紅，李恒，等．高糖高脂飲食誘導(dǎo)的2 型糖尿病大鼠模型及其腎病特點(diǎn)［J］．中國(guó)糖尿病雜志，2002，10(5):35

［2］Sinzato YK，Volpato GT，Iessi IL，et al．Neonatally induced mild diabetes in rats and its effect on maternal，placental，and fetal parameters［J］．Exp Diabetes Res，2012，2012:108163

［3］Sonenberg N，Hinnebusch AG．Regulation of translation initiation in eukaryotes:mechanisms and biological targets［J］．Cell，2009，136(4):731

［4］Evans-Molina C，Hatanaka M，Mirmira RG．Lost in translation:endoplasmic reticulum stress and the decline of β-cell health in diabetes mellitus［J］．Diabetes Obes Metab，2013，15(Suppl 3):159

［5］Van Der Kallen CJ，Van Greevenbroek MM，Stehouwer CD，et al．Endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in the development of diabetes:is there a role for adipose tissue and liver?［J］．Apoptosis，2009，14(12):1424

［6］Toth A，Nickson P，Mandl A，et al．Endoplasmic reticulum stress as a novel therapeutic target in heart diseases［J］．Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets，2007，7(3):205

［7］Cnop M，F(xiàn)oufelle F，Velloso LA．Endoplasmic reticulum stress，obesity and diabetes［J］．Trends Mol Med，2012，18(1):59

［8］Fels DR，Koumenis C．The PERK/eIF2alpha/ATF4 module of the UPR in hypoxia resistance and tumor growth［J］．Cancer Biol Ther，2006，5(7):723

［9］Eizirik DL，Cardozo AK，Cnop M．The role for endoplasmic reticulum stress in diabetes mellitus［J］．Endocr Rev，2008，29(1):42

［10］Matsumoto H，Miyazaki S，Matsuyama SA，et al．Selection of autophagy or apoptosis in cells exposed to ER-stress depends on ATF4 expression pattern with or without CHOP expression［J］．Biol Open，2013，2(10):1084